歐定強(qiáng) 吳承志 劉鈺瑜 戎利民 徐義春 王其友

基礎(chǔ)研究論著

A型核纖層蛋白在腰椎退行性疾病中的表達(dá)及其意義

歐定強(qiáng) 吳承志 劉鈺瑜 戎利民 徐義春 王其友

目的初步探討A型核纖層蛋白（Lamin A）在腰椎退行性疾病中的表達(dá)特點(diǎn)及意義。方法將74例腰椎退行性疾病患者分為腰椎間盤(pán)突出組（32例）及腰椎管狹窄組（42例），另設(shè)腰椎正常組（12例）作為對(duì)照。采用免疫組織化學(xué)檢查（免疫組化）及蛋白免疫印跡法檢測(cè)Lamin A 在3組腰椎間盤(pán)組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。結(jié)果免疫組化顯示Lamin A在3組的椎間盤(pán)細(xì)胞中均有表達(dá)，腰椎管狹窄組的Lamin A在椎間盤(pán)細(xì)胞中的表達(dá)較腰椎正常組及腰椎間盤(pán)突出組明顯；蛋白免疫印跡法檢測(cè)3組椎間盤(pán)的纖維環(huán)組織均有Lamin A的表達(dá)，腰椎管狹窄組Lamin A條帶灰度值為3.55 ±0.16，腰椎間盤(pán)突出組為1.02±0.13，腰椎正常組為0.78±0.14，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F ＝14.326，P＜0.01），腰椎管狹窄組與腰椎間盤(pán)突出組及腰椎正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001），腰椎間盤(pán)突出組與腰椎正常組比較差異尚未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.134）。結(jié)論隨著腰椎退行性疾病病程的發(fā)展，Lamin A的表達(dá)逐漸升高，其可能與腰椎退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系。

A型核纖層蛋白；腰椎間盤(pán)突出；腰椎管狹窄；表達(dá)

腰椎退行性疾病是腰腿痛的重要原因之一。分子機(jī)制的調(diào)控與腰椎疾病密切相關(guān)，有研究顯示，A型核纖層蛋白（Lamin A）在細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程及細(xì)胞應(yīng)力改變過(guò)程中起重要作用，其基因表達(dá)的異常及突變是促進(jìn)退行性疾病發(fā)展的因素之一［1-3］。本研究旨在分析該蛋白在腰椎退行性疾病中的表達(dá)情況及其意義，為臨床提供數(shù)據(jù)參考。

材料與方法

一、標(biāo)本采集

選擇性獲取2014年9月至2015年4月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院行后路腰椎間盤(pán)切除術(shù)74例患者的腰椎間盤(pán)標(biāo)本。所有患者術(shù)前均行常規(guī)的腰椎MRI檢查，以明確腰椎間盤(pán)突出癥或腰椎管狹窄癥的診斷。74例中腰椎間盤(pán)突出32例（腰椎間盤(pán)突出組），男17例、女15例，年齡22～46歲，病程6～12個(gè)月，其中5例標(biāo)本用于行免疫組織化學(xué)檢查（免疫組化），27例標(biāo)本用于蛋白免疫印跡法檢測(cè)；腰椎管狹窄42例（腰椎管狹窄組），男24例、女18例，年齡48～68歲，病程6～24個(gè)月，7例標(biāo)本用于行免疫組化，35例標(biāo)本用于蛋白免疫印跡法檢測(cè)。腰椎正常組的椎間盤(pán)組織來(lái)自同期因脊柱骨折損傷在我院就診而且需行腰椎間盤(pán)切除術(shù)并椎間融合術(shù)的12例患者，其中男7例、女5例，年齡48～68歲，均于脊柱骨折損傷8 h內(nèi)到我院治療，其標(biāo)本均用于行免疫組化。

二、方 法

1.實(shí)驗(yàn)試劑及器械

免疫組化：乙二胺四乙酸（EDTA）修復(fù)液；5%牛血清白蛋白封閉液；3%的實(shí)驗(yàn)用過(guò)氧化氫溶液；辣根過(guò)氧化物酶（DAB）顯色液；蘇木素染液；常規(guī)的二甲苯、乙醇溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）及中性樹(shù)膠；萊卡病理切片機(jī)及倒置顯微鏡。其所使用抗體與下文的蛋白免疫印跡法檢測(cè)所用的抗體相同。

蛋白免疫印跡法檢測(cè)：谷歌生物全蛋白提取試劑盒；凱基生物蛋白濃度測(cè)定試劑盒；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠及5%的濃縮膠；5%脫脂奶粉；目的蛋白一抗抗體（Lamin A）；內(nèi)參蛋白抗體（組蛋白3）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；電化學(xué)發(fā)光（ECL）液；伯樂(lè)電泳及轉(zhuǎn)膜儀；手動(dòng)曝光板。

2.免疫組化分析Lamin A表達(dá)情況

常規(guī)在萊卡切片機(jī)切取5 μm的椎間盤(pán)組織病理切片，于65℃烘箱烘干1.5 h。脫蠟至水后，切片置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，加入3%過(guò)氧化氫溶液室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。常規(guī)用5%牛血清白蛋白封閉20 min后，于每張切片加入50 μl約1∶200倍稀釋的一抗覆蓋組織，置于4℃過(guò)夜。經(jīng)PBS清洗后，每張切片加入50～100 μl的二抗，室溫孵育2 h。滴加100 μl新鮮配制的DAB，觀察到細(xì)胞核周出現(xiàn)棕黃色顆粒則為L(zhǎng)amin A陽(yáng)性表達(dá)。用蘇木素染液復(fù)染切片后，行梯度乙醇（70%～100%，10 min 1個(gè)梯度）脫水干燥，經(jīng)二甲苯透明后行中性樹(shù)膠封固。通過(guò)著色強(qiáng)度判斷其表達(dá)情況的高低（0～＋4級(jí)）［4］。

3.蛋白免疫印跡法檢測(cè)組織Lamin A的表達(dá)

加入體積為纖維環(huán)組織體積10倍的裂解液（使用前加入Cooktail蛋白酶抑制劑、苯甲基磺酰氟和磷酸化蛋白酶抑制劑）并使用勻漿器充分碎裂組織，使用凱基生物蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定所提組織提取液蛋白的濃度。提取液蛋白經(jīng)過(guò)95℃變性后，于10%（或者15%）的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠及5%的濃縮膠上電泳至蛋白分離。電泳后提取凝膠放置在冰上轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上（250 mA，1 h），常規(guī)用5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗（1∶1 000）單克隆抗體過(guò)夜，于4℃孵育及進(jìn)行常溫下二抗的雜交（組蛋白3作為內(nèi)參蛋白）。再用ECL液浸潤(rùn)后，放入X光片夾中曝光、定影及進(jìn)行掃描存檔。采用Image J軟件分析蛋白質(zhì)的灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示Lamin A在椎間盤(pán)細(xì)胞中均有表達(dá)，且主要表達(dá)在細(xì)胞核的周?chē)?。Lamin A在腰椎間盤(pán)突出組的表達(dá)強(qiáng)度為＋2級(jí)（圖1B），而在腰椎管狹窄組中的表達(dá)較強(qiáng)，為＋4（圖1C），在腰椎正常組中的表達(dá)強(qiáng)度為＋1（圖1A）。

二、蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果

3組椎間盤(pán)的纖維環(huán)組織均有Lamin A的表達(dá)，腰椎管狹窄組Lamin A的表達(dá)較腰椎間盤(pán)突出組明顯（圖2）。使用Image J軟件分析獲取腰椎管狹窄組Lamin A條帶灰度值為3.55±0.16，腰椎間盤(pán)突出組為1.02±0.13，腰椎正常組為0.78± 0.14，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝14.326，P ＜0.01），腰椎管狹窄組與腰椎間盤(pán)突出組及腰椎正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001），腰椎間盤(pán)突出組與腰椎正常組比較差異尚未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.134）。

圖1 免疫組化分析Lamin A表達(dá)情況

圖2 蛋白免疫印跡電泳圖

討 論

腰椎間盤(pán)退行性改變是引起腰椎一系列退行性疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，如腰椎管狹窄、腰椎間盤(pán)突出、腰椎滑脫及退行性側(cè)彎等，有研究顯示其發(fā)展與基因的多態(tài)性密切相關(guān)［5-6］。其中，腰椎間盤(pán)突出是腰椎常見(jiàn)疾病之一，其重要的發(fā)病機(jī)制之一即為椎間盤(pán)纖維環(huán)受到外界的應(yīng)力而產(chǎn)生退變及髓核的突出，這表明應(yīng)力的改變會(huì)引起椎間盤(pán)纖維環(huán)基質(zhì)的合成與代謝的改變［7］。

Lamin A在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中及應(yīng)力環(huán)境下起重要作用，已有研究表明隨著年齡的增長(zhǎng)該蛋白在骨骼系統(tǒng)中會(huì)不斷地減少，而在基因敲除小鼠的研究中也證實(shí)了該蛋白表達(dá)的減少會(huì)引起一系列骨代謝改變［8-11］。因此，探討Lamin A在腰椎間盤(pán)突出癥中纖維環(huán)組織的表達(dá)情況尤為重要，可為椎間盤(pán)突出修復(fù)提供分子研究的基礎(chǔ)。

腰椎間盤(pán)突出與腰椎管狹窄有著密切的聯(lián)系，隨著年齡的增長(zhǎng)腰椎間盤(pán)突出的進(jìn)展會(huì)引起繼發(fā)性的腰椎管狹窄［12］。在本研究中，腰椎管狹窄組的Lamin A明顯高表達(dá)，其次為腰椎間盤(pán)突出組，腰椎正常組Lamin A表達(dá)最低。Lamin A表達(dá)的增加使得腰椎組織抗阻及抗壓能力下降，加速了纖維環(huán)的退變破裂，這種持續(xù)性的積累最終使得髓核組織從纖維環(huán)處突出引發(fā)神經(jīng)壓迫癥狀。因此，本研究結(jié)果提示Lamin A與腰椎間盤(pán)疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，我們推測(cè)在人的生命進(jìn)程中，Lamin A可能隨著椎間盤(pán)壓力負(fù)荷的增加而增加，從而使疾病進(jìn)入終末期（腰椎管狹窄組）。

但本研究并未從基因水平上比較腰椎間盤(pán)突出、腰椎管狹窄患者及腰椎正常者的Lamin A基因表達(dá)的情況，并且未能進(jìn)行椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Lamin A在椎間盤(pán)退行性疾病中所扮演的角色［13］。有學(xué)者利用LaminA／C缺陷的斑馬魚(yú)模型證實(shí)了胚胎發(fā)育過(guò)程中LaminA／C缺陷會(huì)引發(fā)骨骼系統(tǒng)發(fā)育的缺陷［14］。另有研究數(shù)據(jù)也說(shuō)明了鋅基質(zhì)金屬蛋白酶24（Zmpste24）的缺乏會(huì)引起LaminA／C基因的缺陷，從而導(dǎo)致干細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力的下降［15］。因此，我們今后需要進(jìn)行更多的有關(guān)Lamin A的基因?qū)W研究，以期從基因?qū)W方面探討Lamin A與腰椎間盤(pán)退行性疾病發(fā)生的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制。

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Expression and significance of type A lamin in lumbar spinal degenerative disease

Ou Dingqiang，Wu Chengzhi，Liu Yuyu，Rong Limin，Xu Yichun，Wang Qiyou.Department of Spine Surgery，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China
Correspondtng author，Wang Qiyou，E-mail：wang＿qiyou＠yeah.net

ObjectiveTo preliminarily explore the expression levels and clinical significance of type A lamin（lamin A）in lumbar spinal degenerative disease.MethodsSeventy four patients diagnosed with lumbar spinal degenerative disease were divided into the lumbar disc herniation（n＝32）and lumbar spinal stenosis groups（n＝42）and healthy subjects were recruited into the control group（n＝12）.The expression of lamin A in the lumbar tissue samples from three groups was assessed by immunohistochemical examination and western blotting.ResultsImmunohistochemical analysis revealed that lamin A was expressed in the intervertebral disk cells from all three groups.The staining of lamin A in the tissue from lumbar spinal stenosis group was stronger than those from the other two groups.Western blot demonstrated that lamin A was expressed in the fibrous ring tissue of intervertebral disk from all three groups.In the lumbar spinal stenosis group，the expression level of lamin A was 3.55±0.16（gray level），1.02±0.13 in the lumbar disc herniation group and 0.78± 0.14 in the control group with statistical significance among three groups（F＝14.326，P＜0.01）.Statistical significance was noted between the lumbar spinal stenosis and lumbar disc herniation group／the control group （both P＜0.001）.There was no statistically significant difference between the lumbar disc herniation and control groups（P＝0.134）.ConclusionsOver the progression of degenerative lumbar spinal disease，the expression level of lamin A is gradually up-regulated，which is probably associated with the incidence and development of degenerative lumbar spinal disease.

Type A lamin；Lumbar disc herniation；Lumbar spinal stenosis；Expression

2015-06-07）

（本文編輯：洪悅民）

10.3969／j.issn.0253-9802.2015.11.003

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B040304006）；2012年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（1057112012）

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院脊柱外科（歐定強(qiáng)，吳承志，戎利民，徐義春，王其友）；524000湛江，廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室（劉鈺瑜）

，王其友，E-mail：wang＿qiyou＠yeah.net

并列第一作者，吳承志