何 偉 秦如齋 張小冬 劉文丹 潘春華

CCR7 是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，主要表達(dá)于未致敏和中央記憶淋巴細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells，DC)表面，其配體為CC 趨化因子配體21 和19 (CC-chemokine Ligand 21/19，CCL21/ 19)，主要表達(dá)于次級淋巴器官(Secondary Lymph Organs，SLO)，包括淋巴結(jié)和派伊爾結(jié)(Peyer's Patches)。CCR7 的主要功能是通過與相應(yīng)配體作用，趨化未致敏T 淋巴細(xì)胞和定植于組織的活化DC 細(xì)胞向SLO 遷移，，使得加載抗原的DC 細(xì)胞能夠激活T 細(xì)胞而啟動免疫反應(yīng)，因此是調(diào)控免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)［1］。近年來發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤細(xì)胞也可以表達(dá)CCR7，利用相似機(jī)制向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［2-4］，抗CCR7 單克隆抗體可明顯抑制腫瘤的生長和侵襲［5］。但是CCR7 參與腫瘤進(jìn)展和淋巴轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和信號通路目前仍不清楚［6］。為此，我們構(gòu)建了小鼠CCR7 基因特異性shRNA 表達(dá)載體，檢測了其對細(xì)胞表面CCR7 表達(dá)的抑制作用，為以后的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

shRNA 真核表達(dá)載體pHBAd-U6 -GFP、人胚腎細(xì)胞系HEK293 細(xì)胞、小鼠MEF 細(xì)胞和LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑購自漢恒生物科技有限公司;大腸桿菌菌株DH5α 是Invitrogen 公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶和DNA Ladder 均購自Fermentas 公司。質(zhì)粒DNA 大量抽提試劑盒是康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠回收試劑盒購自Axygen 公司;DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購于Hyclone 公司;濾膜濾器購自Millipore 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 shRNA 序列的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank 小鼠CCR7 基因已知序列，設(shè)計(jì)三條shRNA，分別稱為:shRNA1、shRNA2 和shRNA3，其編碼的DNA 序列如下:

shRNA1 靶序列:GTGCTTCAAGAAGGATGTGCG

Top Strand (63bp):5' aattcGTGCTTCAAGAAGGATGTGCGTTCAAGAGACGCACATCCTTCTTGAAGCACTTTTTTg-3'

Bottom Strand (63bp ): 5' gatccAAAAAAGTGCTTCAAGAAGGATGTGCGTCTCTTGAACGCACATCCTTCTTGAAGCACg-3'

shRNA2 靶序列:ACATTGCCTATGACGTCACCT

Top Strand (63bp):5' aattcACATTGCCTATGACGTCACCTTTCAAGAGAAGGTGACGTCATAGGCAATGTTTTTTTg-3'

Bottom Strand(63bp):5'gatccAAAAAAACATTGCCTATGACGTCACCTTCTCTTGAAAGGTGACGTCATAGGCAATGTg -3'

shRNA3 靶序列:ACGGATACCTACCTGCTCAAC

Top Strand (64bp):5' aattcACGGATACCTACCTGCTCAACTTCAAGAGAGTTGAGCAGGTAGGTATCCGTTTTTTTg -3'

Bottom Strand(64bp):5'gatccAAAAAAACGGATACCTACCTGCTCAACTCTCTTGAAGTTGAGCAGGTAGGTATCCGTg-3'

引物由桑尼生物合成PAGE 膠純化的oligo 序列，分別稀釋至100 μmol/ L。

1.2.2 CCR7 shRNA 的重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建 ①載體的雙酶切:pHBAd-U6 -GFP 質(zhì)粒載體用BamHI，EcoRI 雙酶切，20 μL 酶切體系為:4 μL 載體(500 ng/μL)+1 μL BamHI +1 μL EcoRI+2 μL 10 ×buffer+12 μL H2O，37 ℃，1 h。酶切完成后常規(guī)膠回收。②單鏈目的基因片段退火連接:采用20 μL退火體系，包括:2 μL 10 ×Buffer、1 μL shDNA -R 和1 μL shDNA-F、16 μL H2O。退火程序?yàn)?95 ℃，10 min→75 ℃，10 min→55 ℃，10 min→35 ℃10 min→15 ℃，10 min。退火產(chǎn)物用無菌雙蒸水1∶100 稀釋待用。③稀釋退火片段與線性化載體的連接:1 μL 稀釋好的退火產(chǎn)物，100 ～200 ng線性化載體，2 μL 連接緩沖液，1 μL T4 -DNA 連接酶，充分混勻后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μL，置于4 ℃過夜。④質(zhì)粒載體的純化和測序鑒定:各取5 μL 過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，分別涂于含有Amp 抗性的LB 平板上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取3 個單克隆菌落，接種于3 mL 含Amp 抗性的LB 培養(yǎng)液中，37 ℃250 r/min 搖菌14 h，將菌液送桑尼生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 重組腺病毒載體的包裝、收毒、擴(kuò)增及滴度測定 ①重組質(zhì)粒的大量制備:將測序正確的對數(shù)生長期的菌液2 mL 加入100 mL 含100 μg/mL Amp 的LB 培 養(yǎng) 基 中，37 ℃300 r/min震蕩搖菌過夜，并提取質(zhì)粒。②重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、包裝及收毒:將293 細(xì)胞接種于含有DMEM +10%胎牛血清的60 mm培養(yǎng)皿中，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70% ～80%匯合時，取重組載體質(zhì)粒及骨架質(zhì)粒，參考說明書用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h 后更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，每天觀察細(xì)胞出毒跡象，即細(xì)胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑。待細(xì)胞大部分病變并從底部脫落進(jìn)行收毒。將所有細(xì)胞及培養(yǎng)液收于15 mL 離心管中，在液氮及37 ℃水浴反復(fù)凍融三次。3 000 r/min 離心5 min，收集含病毒的上清液。該上清即為Ad - CCR7 shRNA 第一代毒種(P1)，用于隨后大量病毒的擴(kuò)增。③第三代毒種的擴(kuò)增、收毒及滴度測定:取2 mL P1 代病毒上清感染一個10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的細(xì)胞(細(xì)胞密度90%以上)。待所有細(xì)胞脫落，將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一同收入15 mL 離心管中，依前述方法凍融三次，取上清備用(P2 代毒種)。每個75 cm2方瓶接種4 ×106個293 細(xì)胞，共接種6 個培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長滿至90%時，將P2 代病毒(除取少量-80 ℃保存外)全部接種培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細(xì)胞完全病變后，離心棄上清，加入6 mL 培養(yǎng)液混勻，于-80 ℃和37 ℃凍融三次，離心取上清，作為第三代病毒(P3)。按文獻(xiàn)記載的方法［7］，采用組織培養(yǎng)半數(shù)感染計(jì)量法(TCID50)測定重組腺病毒的滴度。病毒活性計(jì)算公式如下:對于100 μL 樣品，滴度T =101+d(s-0.5)，其中d =log10 稀釋度=1(對于10 倍的稀釋度而言);S =陽性比率之和(從第一個10 倍稀釋度算起)。將TCID50/mL 轉(zhuǎn)換成PFU/mL:T=a ×10bTCID50/mL =a ×10b-0.7PFU/mL，兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的滴度值應(yīng)相差≤100.7。

1.2.4 病毒感染小鼠MEF 細(xì)胞及Western Blot 檢測 ①病毒感染小鼠MEF 細(xì)胞:種植2 ×105個MEF 細(xì)胞至6 孔板中，待細(xì)胞生長至60% 匯合后，分別感染Ad - GFP，AdCCR7shRNA1，AdCCR7shRNA2，AdCCR7shRNA3 腺病毒，37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 后更換培養(yǎng)液，36 h 后，熒光顯微鏡下觀察GFP 熒光的表達(dá)。②Western Blot 檢測CCR7蛋白表達(dá):細(xì)胞用磷酸緩沖液洗3 遍，刮取細(xì)胞，轉(zhuǎn)移入EP管，置于冰上，加入500 μL RIPA 完全裂解液，冰上裂解2 h，12 000 r/min×30 min，收上清。用BCA 法測定樣本蛋白含量，Western Blot 檢測目的蛋白表達(dá)情況。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的測序鑒定

測序結(jié)果表明:合成的雙鏈DNA 片段已成功插入pHBAd- U6 - GFP 干擾載體的BamHI 和EcoRI 位點(diǎn)之間，CCR7 shRNA1 測序結(jié)果與原設(shè)計(jì)shRNA 有一個堿基不符，經(jīng)人工檢查比對測序結(jié)果后，證實(shí)為測序峰圖讀碼錯誤所引起;而CCR7 shRNA2 和CCR7 shRNA3 測得序列與原設(shè)計(jì)序列完全一致(圖略)。

2.2 重組腺病毒TCID50的測定

培養(yǎng)第10 天在顯微鏡下觀察每孔CPE 情況，并與陰性對照對比，記錄每排樣品的陽性孔數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算出AdCCR7 shRNA1、AdCCR7 shRNA2 和AdCCR7 shRNA3 的病毒滴度分別為1010.7TCID50/mL、1010.9TCID50/mL 和1010.8TCID50/mL，換算成PFU/mL 分別為:1.0 ×1010PFU/mL、1.6 ×1010PFU/mL和1.25 ×1010PFU/mL。

2.3 病毒感染小鼠MEF 細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)36 h 后，熒光倒置顯微鏡下觀察，成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒載體的細(xì)胞均可見報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)(見圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒載體的小鼠MEF 細(xì)胞表達(dá)GFP

2.4 Western Blot 檢測小鼠MEF 細(xì)胞CCR7 蛋白的表達(dá)

如圖2 上半部分所示，36 h 后，同對照細(xì)胞(NC)相比，sh1 組的細(xì)胞CCR7 蛋白表達(dá)明顯減少，sh2 組的蛋白表達(dá)有所下降，而sh3 組的細(xì)胞CCR7 蛋白的表達(dá)無明顯變化。采用Quantity One 圖像分析軟件測得的CCR7 蛋白的相對表達(dá)水平(見圖2 下半部分)分別為:NC 0.638;shRNA1 0.118;shRNA2 0.276;shRNA3 0.563，即與對照相比，三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞CCR7 蛋白表達(dá)水平分別下降81.5%、56.7%和11.8%。上述結(jié)果證明，AdCCR7 - shRNA1 腺病毒構(gòu)建成功，CCR7 下調(diào)效率最明顯。

3 討論

圖2 Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒載體的小鼠MEF 細(xì)胞表達(dá)CCR7 蛋白

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征之一，也是大多數(shù)惡性實(shí)體瘤的首要致死原因。腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是多種因子參與的復(fù)雜過程，是非隨機(jī)和器官特異性的。研究提示:趨化因子及其受體在轉(zhuǎn)移發(fā)生和發(fā)展過程中起著十分關(guān)鍵的作用［8］。許多腫瘤細(xì)胞可高表達(dá)CCR7［8］，通過與SLO 基質(zhì)細(xì)胞相應(yīng)配體的趨化作用而選擇性地向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤組織的CCR7 表達(dá)明顯高于相應(yīng)正常組織或者癌旁組織，并且與患者的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［9］。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，CCR7 -CCL21 相互作用還可促進(jìn)淋巴管生成，有利于局部轉(zhuǎn)移灶的形成［10］，拮抗CCR7 的趨化作用則可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。目前尚不清楚CCR7促進(jìn)惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的詳細(xì)分子機(jī)制，有研究發(fā)現(xiàn):CCR7 可激活整合素αvβ3，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附而發(fā)生轉(zhuǎn)移［11］。CCR7 亦可通過PI3K/ Akt/ mTOR等信號通路激活NF -κB 而增強(qiáng)癌細(xì)胞的存活［12］。在乳腺癌細(xì)胞中，CCR7 可以激活A(yù)KT 信號通路，促進(jìn)VEGF -C 的分泌，增強(qiáng)淋巴管生成［10］，而拮抗VEGF -C 的作用則可以抑制腫瘤細(xì)胞的粘附和侵襲能力［13］。另外，最近還發(fā)現(xiàn)，趨化因子與腫瘤耐藥有關(guān)，抑制趨化因子信號可明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對鉑劑的敏感性［14-15］。綜上所述，CCR7 參與了惡性腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和耐藥，但其機(jī)制尚不清楚。有鑒于此，我們構(gòu)建了小鼠CCR7 基因特異性shRNA 腺病毒表達(dá)載體，采用RNA 干擾技術(shù)進(jìn)一步深入研究腫瘤組織表達(dá)CCR7 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并試圖深入探討其分子機(jī)制和信號通路。

RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double -stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象［16］。RNAi 技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，用于分析哺乳動物細(xì)胞的目的基因功能及腫瘤相關(guān)基因功能的確定。目前已經(jīng)開發(fā)出能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞并持續(xù)表達(dá)shRNA 的真核表達(dá)載體，表達(dá)的shRNA 能夠在體內(nèi)被加工成為小干擾RNA(siRNA)而發(fā)揮特異性基因沉默作用［17］。與使用單克隆抗體［18］或小分子抑制物［19］來拮抗趨化因子受體/配體間的相互作用相比，siRNA 干擾技術(shù)具有拮抗作用更徹底，持續(xù)時間更長久的優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了三個小鼠CCR7 基因特異性重組腺病毒表達(dá)載體，分別稱為AdCCR7 -shRNA1、AdCCR7 -shRNA2 和AdCCR7 -shRNA3，并篩選出敲除效應(yīng)最高的表達(dá)載體AdCCR7 -shRNA1，獲得了大量的可用于感染靶細(xì)胞的高滴度病毒上清，為將來進(jìn)一步研究CCR7 表達(dá)參與惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移、淋巴管生成和耐藥性形成分子機(jī)制和信號通路打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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