璩良，李華善，姜運(yùn)涵，董春升

蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，蘇州 215123

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分子機(jī)制及其在人類疾病基因治療中的應(yīng)用

璩良，李華善，姜運(yùn)涵，董春升

蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，蘇州 215123

CRISPR/Cas系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古生菌中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，用來抵抗外來病毒或質(zhì)粒的入侵。近幾年，由Ⅱ型CRISPR/Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)改造而來的CRISPR/ Cas9基因組編輯技術(shù)蓬勃發(fā)展，被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，并取得了革命性的變化。文章主要綜述了 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的起源與發(fā)展及在生命科學(xué)各研究領(lǐng)域的應(yīng)用，重點(diǎn)介紹了該系統(tǒng)在人類疾病基因治療方面的最新應(yīng)用及脫靶效應(yīng)，以期為相關(guān)領(lǐng)域的科研人員提供參考。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)；適應(yīng)性免疫；基因組編輯

基因組編輯技術(shù)產(chǎn)生于20世紀(jì)80年代，是通過自然狀態(tài)下同源重組(Homologous recombination, HR)途徑對內(nèi)源性基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除或者替換。由于細(xì)胞發(fā)生隨機(jī)同源重組的效率只有百萬分之一，且耗時(shí)長、成本高，因此限制了基因組編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用[1,2]。

21世紀(jì)初，科研人員相繼開發(fā)出鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)技術(shù)[3,4]和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技術(shù)[5～7]，基因組編輯技術(shù)得到迅速發(fā)展。細(xì)胞內(nèi)有兩種DNA損傷修復(fù)途徑：一種是同源介導(dǎo)修復(fù)(Homology directed repair, HDR)，可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的DNA修復(fù)，不會產(chǎn)生基因突變；另一種是非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)，會產(chǎn)生DNA序列的突變。2013年初，Science、Nature、Biotechnology和Cell等雜志幾乎同時(shí)報(bào)道了一種不依賴于 FokⅠ核酸酶的基因組編輯技術(shù)—Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /associated nuclease 9 (CRISPR/Cas9)，該技術(shù)是由細(xì)菌或古生菌中的 CRISPR/Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來。CRISPR/Cas9核酸酶可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因組編輯，實(shí)現(xiàn)對靶基因的敲除、突變、插入以及基因抑制和激活等[8～11]。作為一種新的基因組編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9具有明顯的優(yōu)勢：(1)質(zhì)粒構(gòu)建容易，只要向載體上插入一段20 bp的能夠轉(zhuǎn)錄為sgRNA的DNA片段即可。而ZFN和TALEN在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，需將多個(gè)DNA片段連接后再插入載體中，尤其是TALEN載體的構(gòu)建，通常需要將7～9段1000 bp以上DNA連接后插入目的載體；(2)操作簡單，在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá) Cas9蛋白和靶向目的基因的單導(dǎo)向RNA (Single-guide RNA，sgRNA)，就可以實(shí)現(xiàn)對靶基因DNA的編輯；(3)利用CRISPR/Cas9技術(shù)可在大部分的細(xì)胞和個(gè)體中實(shí)現(xiàn)基因組編輯，可同時(shí)對多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行修飾，實(shí)驗(yàn)周期短，最快僅需兩個(gè)月。本文主要綜述了CRISPR/Cas9適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制以及在基因組編輯中的應(yīng)用，特別是在人類疾病基因治療中的應(yīng)用。

1 細(xì)菌 CRISPR/Cas9適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和作用原理

CRISPR是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族，廣泛分布于細(xì)菌和古生菌基因組中。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要分為TypeⅠ、TypeⅡ、Type Ⅲ 3種不同類型。TypeⅠ是CRISPR系統(tǒng)中Cas蛋白種類最多和最復(fù)雜的一種，多種Cas蛋白與成熟的crRNA(CRISPR RNA)一起參與外源DNA的降解[12,13]。Type Ⅲ系統(tǒng)中的Cas蛋白是Cas10蛋白，該系統(tǒng)分為A和B兩種類型：A型介導(dǎo)mRNA的降解[14]，B型介導(dǎo)外源DNA 的降解[15]。TypeⅡ系統(tǒng)中只有一種核酸酶—Cas9核酸酶，在該系統(tǒng)中Cas9蛋白與crRNA參與對抗外源噬菌體和質(zhì)粒的入侵[16,17]。目前，TypeⅡ系統(tǒng)在基因組編輯中應(yīng)用的最為廣泛。如圖1所示，CRISPR 位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列組成重復(fù)序列的長度通常為 21～48 bp，重復(fù)序列之間被26～72 bp 間隔序列(Spacer)隔開[18～20]。CRISPR就是通過這些間隔序列識別外源DNA。Cas系列基因存在于CRISPR位點(diǎn)附近，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9免疫系統(tǒng)依賴 Cas9內(nèi)切酶家族靶向并切割外源DNA[20]，在這一系統(tǒng)中，crRNA 通過堿基配對與tracrRNA(Trans-activating crRNA)結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合物指導(dǎo)Cas9蛋白在特定的位點(diǎn)切割DNA，其中Cas9的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域切割互補(bǔ)鏈，其RuvC-like結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈[21]。

近期研究也表明，這樣的雙鏈二元復(fù)合體RNA可以被sgRNA所替換，Cas9核酸酶能在sgRNA引導(dǎo)下對靶DNA序列進(jìn)行切割，它與Fok I酶功能類似，但是并不需要形成二聚體就能發(fā)揮作用[22,23](圖2)。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)對病毒和質(zhì)粒入侵的免疫機(jī)制

病毒或質(zhì)粒入侵細(xì)菌后，其基因組DNA暴露于細(xì)菌胞漿之中，CRISPR重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄、翻譯出的Cas復(fù)合物對外來DNA進(jìn)行剪切，產(chǎn)生新的spacer序列。如果產(chǎn)生的新spacer序列能夠與CRISPR array內(nèi)部的短重復(fù)序列部分互補(bǔ)，將會通過某種未知的方式整合到細(xì)菌基因組的CRISPR array 序列中，從而對該病毒或質(zhì)粒產(chǎn)生特異性免疫記憶[22～25]。當(dāng)同類的病毒或者質(zhì)粒再次入侵該細(xì)菌時(shí)，被插入的新的spacer序列與短重復(fù)序列一起融合轉(zhuǎn)錄為crRNA轉(zhuǎn)錄的spacer序列可以與病毒或者質(zhì)粒的DNA進(jìn)行互補(bǔ)，而與 spacer序列融合的短重復(fù)序列可以與tracrRNA部分互補(bǔ)形成 RNA和 RNA復(fù)合物，此RNA二元復(fù)合物可與 Cas9 核酸酶結(jié)合，并引導(dǎo)Cas9核酸酶切割特定互補(bǔ)序列的雙鏈DNA，從而破壞入侵病毒或者質(zhì)粒的DNA，使其不能在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。具體機(jī)制如圖3所示。

圖1 CRISPR/Cas的結(jié)構(gòu)

圖2 CRISPR/Cas9作用原理

圖3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)對病毒和質(zhì)粒入侵的免疫機(jī)制

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

研究證明Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需利用Cas9核酸酶與sgRNA協(xié)同作用就可以完成對入侵DNA的切割[26]。目前，全世界多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)相繼證明了CRISPR/Cas9核酸酶可以在線蟲(Caenorhabditis elegans)、斑馬魚(Danio rerio)、果蠅(Drosophila melanogaster)、細(xì)菌和酵母等模式生物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因組編輯。sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶在特定的DNA序列進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈末端斷裂，細(xì)胞可以通過HDR或 NHEJ兩種途徑進(jìn)行修復(fù)，當(dāng)細(xì)胞通過NHEJ途徑進(jìn)行修復(fù)時(shí)，在連接處有堿基的缺失與插入，會產(chǎn)生開放閱讀框的移碼突變使靶基因失活，實(shí)現(xiàn)基因敲除[27,28]。CRISPR/Cas9技術(shù)作為生命科學(xué)領(lǐng)域研究技術(shù)手段的一個(gè)革命性的突破，在構(gòu)建基因敲除小鼠、遺傳性疾病研究、抗病毒研究、癌癥研究、功能基因篩選、轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究、單分子標(biāo)記研究和基因治療研究等領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用。

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯上的應(yīng)用

CRISPR/Cas9作為最新的基因組編輯技術(shù)，最直接的應(yīng)用就是對靶基因進(jìn)行精確的編輯。靶向目的基因的sgRNA和Cas9核酸酶在真核細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)，sgRNA可以引導(dǎo)Cas9核酸酶識別靶基因序列并進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈末端斷裂 DNA，引發(fā)胞內(nèi) HDR或者NHEJ DNA修復(fù)途徑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)有目的基因同源臂的外源DNA時(shí)，可以通過HDR途徑實(shí)現(xiàn)外源基因的敲入[27～31]。最近，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院張連峰教授利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地將EGFP基因敲入TRDMT1基因座位上[32]。袁晶等[33]運(yùn)用Cas9基因組編輯技術(shù)，對瘧原蟲(Plasmodium)的基因組實(shí)行了基因刪除、基因敲入和核苷酸替換。該研究將Cas9質(zhì)粒、sgRNA質(zhì)粒與含有同源臂的donor質(zhì)粒通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)到瘧原蟲的細(xì)胞核中，成功地實(shí)現(xiàn)了對1.7 kb、4.0 kb和 5.0 kb大小的基因刪除，發(fā)現(xiàn)同源臂越長，基因刪除的效率越高。此外，他們運(yùn)用類似的方法成功在瘧原蟲PYO3652基因上融合了myc標(biāo)簽和gfp標(biāo)記。用此方法可以便于后續(xù)的免疫印跡和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)操作，而不需要購買一些昂貴的抗體或耗費(fèi)大量的時(shí)間制備抗體。熒光標(biāo)記(如GFP, mCherry等)的引入為觀察體內(nèi)細(xì)胞顯微條件下蛋白的表達(dá)與定位提供了極大的便利。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因治療遺傳性疾病方面的應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)在基因治療遺傳性疾病方面也有著廣泛的應(yīng)用前景。人類基因組中約有25 000個(gè)基因，其中大約3000個(gè)基因的突變與人類疾病相關(guān)，如血友病、苯丙酮尿癥、囊性纖維病等。CRISPR/Cas9技術(shù)可以使基因組中突變的基因失活或者糾正突變的基因，因此可以從根本上治愈這些基因突變導(dǎo)致的遺傳性疾病。2014年，Nature Biotechnology、Science 雜志相繼報(bào)道了運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)治療FAH基因突變的酪氨酸血癥[31]和杜氏肌營養(yǎng)不良疾病[34]。同年8月5日，Xie 等[35]報(bào)道了通過該技術(shù)治療地中海貧血癥，該研究者將地中海貧血癥患者的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)分化為誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(Inducible pluripotent stem cell，iPSC )，隨后利用CRISPR/Cas9技術(shù)修復(fù)HBB基因，并將基因修復(fù)后的iPSC誘導(dǎo)分化成紅細(xì)胞，該紅細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)正常的HBB蛋白。該研究利用了piggyBac轉(zhuǎn)座子，因此細(xì)胞基因組中沒有插入基因編輯操作所帶的篩選標(biāo)記。此研究不僅為治療人類地中海貧血癥提供了很好的思路，也為以后干細(xì)胞的基因治療提供了一種全新的借鑒方法。2013年，李勁松課題組以小鼠為模型，利用CRISPR/Cas9技術(shù)糾正白內(nèi)障模型小鼠受精卵中的 Crygc基因，發(fā)現(xiàn)由該處理組受精卵發(fā)育而來的小鼠的白內(nèi)障癥狀較對照組有了顯著地改善[36]。

2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因治療病毒感染性疾病方面的應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)在治療病毒感染性疾病中也有著良好的應(yīng)用前景。2013年 11月 14日，Virus雜志上的一篇綜述對CRISPR/Cas9技術(shù)用于治療人類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染進(jìn)行了展望[37]，指出可以將HIV感染者的骨髓干細(xì)胞分離出來，運(yùn)用Cas9基因組編輯技術(shù)在體外將HIV-1的宿主細(xì)胞輔助受體CCR5或CXCR4基因失活，再將CCR5或CXCR4基因失活的 CD34+造血干細(xì)胞回輸給該患者，這些經(jīng)過基因編輯的骨髓干細(xì)胞可以分化為產(chǎn)生抵抗HIV-1感染的CD4+T細(xì)胞。另外，Kamel Khalili研究小組采取直接靶向HIV-1基因組DNA的治療策略利用CRISPR/Cas9構(gòu)建靶向HIV-1的LTR U3區(qū)的sgRNA[38]，該sgRNA可以引導(dǎo)Cas9核酸酶識別已經(jīng)整合到HIV-1感染者細(xì)胞基因組上的病毒前基因組DNA，并在5′LTR U3區(qū)和3′LTR U3區(qū)進(jìn)行切割，從而可以從感染者的基因組上切除已經(jīng)整合的病毒前基因組DNA，因而可以抑制HIV-1在體內(nèi)的復(fù)制，但是HIV-1前基因組DNA在感染者CD4+T細(xì)胞中拷貝數(shù)較多，Cas9核酸酶是否能將CD4+T細(xì)胞中整合的病毒前基因組拷貝都切除還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

慢性乙型肝炎由人類乙型肝炎病毒(HBV)感染導(dǎo)致，是肝硬化和肝癌的主要誘因之一。HBV的共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA(cccDNA)對于病毒的持續(xù)性感染起了主要作用。因此，清除被感染肝細(xì)胞內(nèi)的HBV cccDNA是臨床上徹底治愈慢性乙型肝炎的關(guān)鍵。多項(xiàng)研究表明，CRISPR/Cas9技術(shù)可以特異性地靶向HBV cccDNA，從而有效抑制HBV的復(fù)制[39～43]Seeger等[42]采用了穩(wěn)定表達(dá) HBV受體 NTCP的HepG2細(xì)胞系，然后用HBV去感染該細(xì)胞并轉(zhuǎn)染表達(dá)Cas9蛋白和靶向HBV cccDNA的sgRNA，證實(shí)Cas9核酸酶的確可以靶向切割 HBV 的基因組cccDNA，并使其通過NHEJ途徑進(jìn)行修復(fù)，引起核苷酸的缺失或插入，從而抑制 HBV 在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。我們實(shí)驗(yàn)室也成功構(gòu)建了靶向HBV基因組的 Cas9質(zhì)粒并證明在細(xì)胞和小鼠體內(nèi)能有效清除HBV cccDNA，抑制病毒復(fù)制[39]。此外，Suenaga等[44]運(yùn)用 CRISPR/Cas9技術(shù)對單純皰疹病毒(HSV)基因組進(jìn)行基因組編輯，成功實(shí)現(xiàn)了對HSV基因組進(jìn)行基因敲除與敲入，這些突變后的HSV可以應(yīng)用于癌癥治療，該研究為其他DNA病毒如EB病毒、巨細(xì)胞病毒等的基因組學(xué)研究提供了一種新的思路。

2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在癌癥方面的應(yīng)用

2014年，Torres等[45]首次報(bào)道了應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建癌癥模型的研究，在該研究中Cas9在特異性sgRNA的引導(dǎo)下，在染色體特定位點(diǎn)DNA處進(jìn)行切割，使被切割的染色體發(fā)生倒位和異位，準(zhǔn)確模擬了人類一些腫瘤例如急性髓系白血病和尤文氏肉瘤的形成過程。同年，Xue等[46]運(yùn)用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)成功地將抑癌基因p53和pten進(jìn)行雙突變，構(gòu)建了肝癌動(dòng)物模型。Platt等[47]報(bào)道了小鼠腫瘤模型，將器官靶向的各種亞型的AAV載體作為CRISPR/Cas9的遞送系統(tǒng)，在肝、腦、肺等器官中實(shí)現(xiàn)Cas9核酶的特異性表達(dá)，并且成功構(gòu)建了肺腺癌小鼠模型。由此可見，AAV載體與CRISPR/Cas9技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用將會在癌癥的個(gè)體化治療中發(fā)揮越來越重要的作用。

2.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在高通量篩選和功能基因組學(xué)上的應(yīng)用

近來，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)慢病毒介導(dǎo)的功能基因篩選文庫在高通量篩選和功能基因組學(xué)的應(yīng)用取得了很大進(jìn)展。2014年1月，Shalem等[48]成功構(gòu)建了由慢病毒介導(dǎo)的靶向 18 080個(gè)基因的CRISPR-Cas9 knockout(GeCKO)文庫。他們首先運(yùn)用GeCKO文庫驗(yàn)證了腫瘤細(xì)胞或多能干細(xì)胞生存相關(guān)的幾個(gè)已知基因，然后又以黑色素瘤為模型，通過該文庫成功篩選了在黑色素瘤發(fā)生過程中幾個(gè)關(guān)鍵基因，如NF2、CUL3、TADA2B和TADA1。與此同時(shí)，Wang等[49]也成功地構(gòu)建了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的慢病毒sgRNA基因篩選文庫，并通過此文庫證實(shí)了DNA錯(cuò)配修復(fù)過程中的所有關(guān)鍵基因，而且還發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤藥 etoposide作用的兩個(gè)靶基因TOP2A和 CDK6。北京大學(xué)魏文勝教授課題組也報(bào)道了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的慢病毒sgRNA細(xì)胞文庫[50]，并且建立了功能基因篩選平臺以及通過高通量測序技術(shù)分析數(shù)據(jù)的一整套技術(shù)路線。他們利用這一基因篩選技術(shù)，成功鑒定出白喉毒素和炭疽毒素的細(xì)胞表面受體，為研究病原菌與宿主相互作用和信號通路提供了極大的便利。

2.6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在研究基因表達(dá)調(diào)控方面的應(yīng)用

sgRNA可以引導(dǎo) Cas9核酸酶識別并切割靶DNA序列，對 Cas9蛋白中具有核酸酶活性的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變得到無核酸酶活性的Cas9 (dCas9)，再將其與一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制或者轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白在sgRNA的引導(dǎo)下靶向識別目的基因啟動(dòng)子區(qū)域，融合表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域會招募相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而準(zhǔn)確特異地調(diào)控靶基因的表達(dá)(圖4)。已有報(bào)道表明利用此原理建立 CRISPR-ON系統(tǒng)[51]，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域顯著地激活了IL1RN、SOX2和OCT4報(bào)告基因的表達(dá)。Qi等[52,53]利用類似的方法在人類細(xì)胞和酵母細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了對基因的激活或抑制。在該研究中，他們將這種Cas9介導(dǎo)的抑制細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的方法稱為CRISPRi。CRISPRi有以下優(yōu)勢：(1)針對不同的目的基因，只需設(shè)計(jì)一個(gè) sgRNA即可；(2)可以在同一個(gè)細(xì)胞中設(shè)計(jì)多個(gè)針對不同基因啟動(dòng)子的sgRNA，同時(shí)研究多個(gè)基因的表達(dá)、激活或抑制；(3)RNAi作用于翻譯階段，而CRISPR作用于轉(zhuǎn)錄階段，因此 CRISPR調(diào)控基因表達(dá)的效率會高很多，作用會更明顯。

2.7 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在活細(xì)胞單分子標(biāo)記領(lǐng)域中的應(yīng)用

活細(xì)胞單分子標(biāo)記技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)單個(gè)分子構(gòu)象變化和動(dòng)力學(xué)的一門前沿技術(shù)。2013年，Chen 等[54]將 Cas9核酸酶中具有核酸酶活性的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，使其喪失核酸酶活性，再將失去核酸酶活性的dCas9蛋白與綠色熒光蛋白EGFP融合；在活細(xì)胞內(nèi)，靶向染色體端粒重復(fù)序列的 sgRNA將dCas9-EGFP引導(dǎo)到端粒區(qū)域，使得染色體末端端粒區(qū)域發(fā)出熒光，借此可以清晰觀察活細(xì)胞內(nèi)端粒的延伸與縮短；在此基礎(chǔ)上，他們設(shè)計(jì)了靶向單拷貝基因MUC4的sgRNA，成功觀察到綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的MUC4基因。由此可見，CRISPR/Cas9系統(tǒng)與單分子標(biāo)記技術(shù)的有效結(jié)合，可為研究活細(xì)胞內(nèi)染色體和基因的構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)提供一種強(qiáng)大工具。

圖4 Cas9系統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)的作用機(jī)制

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展與展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是靶向基因編輯的一項(xiàng)利器，在構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系和基因敲除動(dòng)物模型、基因治療遺傳疾病和感染性疾病等研究領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景，但是該技術(shù)也存在著一定弊端如脫靶效應(yīng)，這也是基因治療應(yīng)用中急需解決的問題之一。脫靶效應(yīng)會導(dǎo)致基因組中其他序列突變、癌基因激活等不良后果，給臨床應(yīng)用帶來風(fēng)險(xiǎn)。Duan等[55]通過深度測序分析靶向emx1基因的sgRNA結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，除了OT2-1 和OT2-4兩個(gè)位點(diǎn)外，大部分脫靶效應(yīng)位點(diǎn)雖然含有與靶向RNA互補(bǔ)的10～12 bp的種子序列和3 bp的PAM序列(NGG)，但Cas9并不切割這些脫靶位點(diǎn)。研究人員還發(fā)現(xiàn)Cas9核酸酶的脫靶效應(yīng)具有細(xì)胞特異性，他們猜想染色質(zhì)構(gòu)象和其他的表觀遺傳因素參與此調(diào)控。2013年9月，張鋒課題組通過將Cas9蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域突變，使得突變的dCas9蛋白只能對靶向DNA的一條鏈進(jìn)行切割。這樣對于某個(gè)基因 DNA雙鏈的切割可以通過設(shè)計(jì)兩條不同識別序列的sgRNA完成，該策略可使脫靶效應(yīng)降低1000倍[30]。 隨后，Tsai等[56]和Guilinger 等[57]各自報(bào)道了融合蛋白 dCas9-FokⅠ可有效降低CRISPR的脫靶效應(yīng)。研究人員通過構(gòu)建表達(dá)dCas9-FokⅠ，兩個(gè)sgRNA分別引導(dǎo)dCas9-FokⅠ結(jié)合到相距15～20 bp的靶DNA區(qū)域，F(xiàn)okⅠ實(shí)現(xiàn)二聚化而被激活，對中間的DNA序列進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈末端斷裂。

如何有效地將 Cas9基因組編輯質(zhì)粒準(zhǔn)確地靶向運(yùn)輸?shù)教囟ǖ募?xì)胞、組織和器官中，實(shí)現(xiàn)精確導(dǎo)向的的基因治療[58～62]，也是當(dāng)今基因治療領(lǐng)域的一大難題。在體外對一些細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，可以用電穿孔或病毒載體將 Cas9基因組編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞之中。電穿孔的方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的損傷較大，這些細(xì)胞在體外經(jīng)過電穿孔處理后，細(xì)胞的活力可能會降低，回輸?shù)襟w內(nèi)后達(dá)不到理想的效果。病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體等在體外應(yīng)用比較廣泛[63～65]。利用慢病毒載體可以使細(xì)胞穩(wěn)定、持續(xù)表達(dá) Cas9核酸酶和sgRNA，從而取得較高的基因敲除效率，但也會相對地增加 Cas9核酸酶的脫靶效應(yīng)；值得注意的是，慢病毒載體在細(xì)胞基因組中隨機(jī)整合，可能會激活癌基因的表達(dá)，在應(yīng)用于基因治療時(shí)不容忽視。在體內(nèi)基因遞送和基因治療應(yīng)用中，腺相關(guān)病毒AAV載體應(yīng)用十分廣泛。Platt等[47]將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)與AAV系統(tǒng)相結(jié)合，成功地對小鼠腦細(xì)胞進(jìn)行了基因編輯，還構(gòu)建了肺腺癌小鼠模型。也有報(bào)道利用AAV遞送Cas9基因編輯系統(tǒng)，成功地對小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞的多個(gè)基因進(jìn)行編輯，觀察到了小鼠行為上的變化[66]。除了AAV載體外，納米顆粒和脂質(zhì)體也是一種充滿前景的遞送工具[67,68]。納米顆粒或脂質(zhì)體可以包裹按一定比例配制的表達(dá)Cas9核酸酶的mRNA和sgRNA, 作為藥物被攝入體內(nèi)。這可以更好地控制服用劑量，并且也極大的降低了機(jī)體對于外來刺激的免疫反應(yīng)。

綜上所述，CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)重要的發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)造，在生命科學(xué)研究的領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展，其在人類疾病基因治療中必將具有光明的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編委: 謝建平)

The molecular mechanism of CRISPR/Cas9 system and its application in gene therapy of human diseases

Liang Qu, Huashan Li, Yunhan Jiang, Chunsheng Dong
Institutes of Biology and Medical Sciences (IBMS ), School of Medicine, Soochow University, Suzhou 215123, China

CRISPR/Cas system is an adaptive immune system that confers resistance to exogenous virus or plasmid in bacteria and archaea. In recent years, the booming CRISPR/Cas9 genome editing technology modified from typeⅡCRISPR/Cas adaptive immune system has been widely applied to various research fields of life science and led to revolutionary changes. In this review, we summarize the origin and development of CRISPR/Cas9 genome editing technology as well as its applications in life science research. We focus on the latest application of this system in gene therapy of human diseases and the associated side/off-target effects, which may provide references for researchers in related areas.

CRISPR/Cas9 system; adaptive immune system; genome editing

2015-03-16;

2015-07-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：K113415011)，江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號：201310285046Z)和蘇州市科技局項(xiàng)目(編號：SYS201452)資助

璩良，本科生，專業(yè)方向：生物技術(shù)(免疫工程)。E-mail: quliangsuda@163.com

董春升，副教授，研究方向：免疫學(xué)。 E-mail：chunshengdong@suda.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-109

時(shí)間:2015-8-4 9:37:07

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150804.0937.004.html