王慧，李光，王義權(quán)廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361102

文昌魚Hedgehog基因敲除和突變體表型分析

王慧，李光，王義權(quán)
廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361102

文昌魚隸屬脊索動(dòng)物門頭索動(dòng)物亞門，是無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的過渡類群，其軀體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是研究胚胎發(fā)育的理想材料。本文以文昌魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用TALEN敲除技術(shù)對(duì)Hedgehog(Hh)基因在胚胎發(fā)育中的功能進(jìn)行了研究。在文昌魚Hh基因翻譯起始位點(diǎn)下游附近選取TALEN目標(biāo)位點(diǎn)，根據(jù)此序列組裝相應(yīng)TALEN重組質(zhì)粒，體外合成mRNA，向未受精卵注射mRNA后，經(jīng)體外受精獲得F0代胚胎。效率分析顯示，靶向該基因的TALEN mRNA可導(dǎo)致F0代胚胎在相應(yīng)基因組區(qū)域發(fā)生突變的比例為34%。對(duì)部分F0個(gè)體所產(chǎn)配子篩查發(fā)現(xiàn)，TALEN引起的突變可進(jìn)入配子，將其中1尾突變類型為8 bp缺失的雄性個(gè)體與野生型雌性配對(duì)獲得F1群體，對(duì)F1群體逐尾篩查，從中獲得多尾攜帶8 bp缺失的雜合子；這些雜合子相互配對(duì)所產(chǎn)的F2代胚胎，其中約有1/4個(gè)體在幼體早期出現(xiàn)軀體前端和尾向下彎曲、脊索前端腹側(cè)的中胚層組織發(fā)育不全，不能開口等；隨著幼體生長(zhǎng)發(fā)育，軀體前端和尾部進(jìn)一步卷曲，口部仍未形成，左右各形成一個(gè)口前窩，內(nèi)柱和鰓裂位于軀體腹側(cè)，最終因無口攝食而死亡?；蛐头治霭l(fā)現(xiàn)，上述畸形胚胎均為Hh純合突變體，其與雜合子及野生型比例分布符合孟德爾遺傳定律，表明這些發(fā)育畸型的特征與Hh基因功能缺失有關(guān)。

TALEN；基因敲除；文昌魚；Hedgehog基因；突變體

Hedgehog(Hh)基因最早由 Nvsslein-Volhard和Wieschaus在篩選影響果蠅胚胎軀體結(jié)構(gòu)的基因時(shí)被發(fā)現(xiàn)[1]，此后科研人員又在其他物種中陸續(xù)鑒定出其同源基因。脊椎動(dòng)物中有3個(gè)Hh同源基因，分別是 Shh(sonic hedgehog)、Ihh(indian hedgehog)和Dhh(desert hedgehog)，其中Shh在脊椎動(dòng)物各類群中都非常保守，其功能也最重要。在胚胎發(fā)育過程中，Shh主要在脊索表達(dá)，成熟的 Shh蛋白由此向四周擴(kuò)散，進(jìn)入位于其背側(cè)的神經(jīng)管中，形成一個(gè)Shh蛋白濃度梯度，決定不同類型神經(jīng)元的分化[2]；Shh蛋白向兩側(cè)擴(kuò)散進(jìn)入體節(jié)，可誘導(dǎo)生骨節(jié)標(biāo)記基因Pax1表達(dá)[3]，從而指導(dǎo)中軸骨骼的形成，還能誘導(dǎo)生肌節(jié)分化成 SSF(Superficial slow fibres)和MP(Muscle pioneer)等類型的肌細(xì)胞[4]；此外，研究還發(fā)現(xiàn) Shh蛋白調(diào)控脊椎動(dòng)物附肢前-后軸的圖式形成[5]。實(shí)際上，Hh基因廣泛存在于無椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，在胚胎發(fā)育的早期參與動(dòng)物體軸的發(fā)生和附肢軸向的確定等。

文昌魚隸屬脊索動(dòng)物門頭索動(dòng)物亞門，是無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的過渡類群[6]。它們軀體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但有與脊椎動(dòng)物相似的軀體構(gòu)筑模式(Body plan)，是研究脊椎動(dòng)物器官發(fā)生和起源的重要?jiǎng)游锬Ｐ?。在文昌魚基因組中，僅有1個(gè)Hh同源基因，主要表達(dá)在脊索和底板(Floor plate)[7]，與脊椎動(dòng)物中的 Shh基因表達(dá)位置相似；此外，文昌魚的 Hh基因還在左側(cè)咽內(nèi)胚層表達(dá)，類似雞胚中 Shh基因的左右不對(duì)稱表達(dá)[8]，提示該基因的功能與脊椎動(dòng)物Shh的功能存在某些共同之處，但該基因在文昌魚胚胎發(fā)育過程中與哪些重要器官的發(fā)生有關(guān)尚不清楚。因此，建立文昌魚Hh基因突變體，對(duì)深入研究該基因在文昌魚胚胎發(fā)育中的功能、揭示脊椎動(dòng)物獨(dú)特軀體構(gòu)筑模式的起源都是十分必要的。本實(shí)驗(yàn)室于2014年將TALEN技術(shù)應(yīng)用于文昌魚基因的定點(diǎn)敲除，首次成功地敲除了文昌魚基因組中 7個(gè)基因，但由于基因敲除后文昌魚的死亡率高和文昌魚本身世代時(shí)間長(zhǎng)的原因，當(dāng)時(shí)暫未獲得能夠?qū)⒐δ苋笔Щ騻鬟f下去的子代[9]。本研究利用TALEN技術(shù)敲除文昌魚Hh基因，經(jīng)過精心養(yǎng)護(hù)獲得了可傳代的Hh基因功能缺失的文昌魚突變體雜合子，從而能夠細(xì)致地觀察 Hh基因缺失后對(duì)文昌魚胚胎發(fā)育的影響，這是文昌魚中第一例基因敲除突變體。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

按照本實(shí)驗(yàn)室之前的報(bào)道[10]，將引種來的佛羅里達(dá)文昌魚(Branchiostoma floridae)飼養(yǎng)在方形塑料桶中(50 cm×35 cm×30 cm)，桶底墊約5 cm的海沙，水面高出沙面 5～10 cm，連續(xù)充氣，喂以單胞藻。性腺成熟的文昌魚個(gè)體經(jīng)熱誘導(dǎo)分別獲得成熟的卵子或精子，卵子用于顯微注射[11]，完成注射后人工受精。

1.2 TALEN質(zhì)粒構(gòu)建與顯微注射

利用TALEN技術(shù)敲除文昌魚Hh基因，參考文獻(xiàn)[12]并按以下原則選擇目標(biāo)位點(diǎn)：(1)識(shí)別靶點(diǎn)序列通常在16～20 bp，左右靶點(diǎn)間隔序列在14～20 bp；(2)識(shí)別靶點(diǎn)序列前的1個(gè)堿基為T；(3)識(shí)別靶點(diǎn)序列包含的G堿基盡量少；(4)一對(duì)TALEN的2個(gè)識(shí)別靶點(diǎn)應(yīng)位于同一外顯子上。按照以上原則，本文在佛羅里達(dá)文昌魚Hh基因上選取了1個(gè)TALEN的目標(biāo)位點(diǎn)，識(shí)別序列為：5'-CGCAAGCTCACCCCCT-3'(左靶點(diǎn))和 5'-GATGCCGGCGGTCTCCG-3'(右靶點(diǎn))，間隔序列含1個(gè)BsrGⅠ酶切位點(diǎn)。構(gòu)建TALEN所需模塊和骨架質(zhì)粒全部購自Addgene公司，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前的報(bào)道[9]，采用Golden Gate方法完成組裝。

構(gòu)建好的TALEN質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ將其線性化，再用Ambion公司的T3試劑盒體外合成mRNA。將成對(duì)的TALEN mRNA(約200 ng/μL)、甘油(100%)、德克薩斯紅熒光染料(5 mg/mL)以3.5:1:0.5體積比混合，其中熒光染料用于指示mRNA注射進(jìn)入卵子，按照本實(shí)驗(yàn)室已建立的顯微注射方法[13]，將TALEN mRNA注入文昌魚成熟的未受精卵中，注射完成后滴加適量精液使卵受精，同時(shí)在另一個(gè)培養(yǎng)皿中受精一些同一雌性個(gè)體產(chǎn)、但未經(jīng)注射的卵子作為對(duì)照。體視顯微鏡下觀察到受精膜舉起時(shí)即刻更換新鮮海水，徹底去除過量的精液和溶解在海水中的多聚賴氨酸，同時(shí)清除顯微注射時(shí)損壞的卵子，然后放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度25℃，濕度90%)中培養(yǎng)。待胚胎發(fā)育至原腸早期，在熒光體視顯微鏡(Olympus公司)下，去除注射不成功的胚胎(不發(fā)紅色熒光)。

1.3 突變效率檢測(cè)

待胚胎發(fā)育至神經(jīng)胚晚中期，在注射組和對(duì)照組中分別取約200枚胚胎，放于1.5 mL塑料離心管中，用酚-氯仿法提取基因組DNA用作PCR擴(kuò)增模板。PCR引物設(shè)計(jì)分別位于左、右靶點(diǎn)的上游和下游，二者間隔約400 bp，引物序列為：

Hh-Talen-F：5'-GAATTTAGCCGTTAATAGGGAG-3'；Hh-Talen-R：5'-GCGAGTAATCCGTCCG TTGA-3'。PCR產(chǎn)物用Omega公司的試劑盒純化回收，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BsrGⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如TALEN注射組胚胎的PCR產(chǎn)物中有未被限制酶切開的完整條帶，則說明靶點(diǎn)處發(fā)生了突變，根據(jù)未切開PCR條帶占所有條帶的熒光亮度百分比，可以大致估測(cè)TALEN的突變效率。

1.4 突變體篩選

1.4.1 F0代培養(yǎng)及配子篩選

用有效的TALEN mRNA注射未受精卵，受精后獲得F0代，于恒溫恒濕下精心培養(yǎng)胚胎至幼體早期，然后轉(zhuǎn)移至較大的方形塑料桶中，于28℃魚房中培養(yǎng)，此時(shí)的桶底不必墊沙，根據(jù)幼體密度投喂適量的單細(xì)胞藻，保持通氣，并每日更換約一半海水。大約 1個(gè)月后，幼體開始變態(tài)，此時(shí)在桶底鋪墊約1 cm厚細(xì)沙，供變態(tài)的幼體及時(shí)鉆入沙中。變態(tài)后的亞成體飼養(yǎng)管理與成體基本相同，即保持通氣、按時(shí)飼喂、定期換水和洗沙[14]，經(jīng)2個(gè)月的飼養(yǎng)后，F(xiàn)0代文昌魚逐漸性成熟。對(duì)性腺成熟個(gè)體采用溫度和光照誘導(dǎo)的方法[11]催產(chǎn)，催產(chǎn)前將待產(chǎn)個(gè)體在22℃低溫中養(yǎng)殖10 d以上，再于27℃高溫中熱激24 h，之后將每一個(gè)個(gè)體單獨(dú)置于250 mL的一次性塑料杯中，熄燈后(文昌魚在黑暗條件下產(chǎn)卵) 于27℃水溫中催產(chǎn)；每隔30 min觀察一次，若發(fā)現(xiàn)排卵或精液個(gè)體，及時(shí)從杯中取出F0親本并編號(hào)，于另一個(gè)杯中暫養(yǎng)，卵子或精液的編號(hào)與親本個(gè)體一一對(duì)應(yīng)。

用 PCR產(chǎn)物-酶切方法檢測(cè)配子以篩選出生殖細(xì)胞中帶有靶位點(diǎn)突變的F0親本。因卵子富含卵黃，不易提取基因組DNA，所以雌性個(gè)體產(chǎn)下的卵子先用野生型(WT)成體產(chǎn)的精液受精，待受精卵發(fā)育一段時(shí)間后再用Qiagen公司的DNA提取試劑盒提取胚胎的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)；而雄性個(gè)體所產(chǎn)的精液可以直接用酚-氯仿法提取基因組DNA檢測(cè)。配子檢測(cè)如果有突變，即將其對(duì)應(yīng)的F0親本單獨(dú)飼養(yǎng)，使其再次產(chǎn)卵或者產(chǎn)精，并與野生型的成體雜交，以獲取F1代。

1.4.2 F1代亞成體篩選

因篩得的F0代中通常僅部分配子的目標(biāo)基因被敲除，為獲得攜有突變基因的F1代，需要對(duì)F1代個(gè)體進(jìn)行逐尾檢測(cè)，然后把攜帶突變基因的個(gè)體培養(yǎng)成熟并繁殖。因此本研究中待F1幼體生長(zhǎng)至亞成體(體長(zhǎng)約 2 cm)時(shí)便開始逐尾檢測(cè)，提早檢測(cè)可以對(duì)少數(shù)攜帶突變基因的個(gè)體加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，促進(jìn)其性腺發(fā)育。剪切單一個(gè)體的尾尖，提取基因組DNA，經(jīng) PCR-酶切初步鑒定后，選擇有突變個(gè)體的 PCR產(chǎn)物，進(jìn)一步克隆測(cè)序，逐條分析靶位點(diǎn)突變類型。切取少許尾尖組織(通常小于1 mm)，以確保切完尾尖的個(gè)體存活力不受影響，為避免傷口感染，使用的海水經(jīng)滅菌處理，切完尾尖的個(gè)體單獨(dú)置250 mL一次性塑料杯中，在 19～22℃低溫中暫養(yǎng)，其間少量投餌，2～3 d后將突變類型相同的個(gè)體放在同一個(gè)深色的3 L塑料小桶里，放回魚房中正常飼養(yǎng)，適當(dāng)加強(qiáng)餌料投喂，待其性腺發(fā)育成熟。

1.4.3 F2代獲得及純合突變體鑒定

選取攜帶相同突變類型的性成熟雌雄F1個(gè)體，按文獻(xiàn)[11]報(bào)道的熱激誘導(dǎo)產(chǎn)卵(精)方法，獲得卵子和精液后，將適量精液與卵子混合，受精后的胚胎即為F2代。雄性若提前產(chǎn)精，可將精液保存在4℃冰箱1～2 d，用前在普通正置顯微鏡下檢查精子是否還仍有活力，精子游動(dòng)越劇烈，表明活力越強(qiáng)，使用時(shí)受精效果越好。將F2胚胎放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期在體視顯微鏡下觀察F2代胚胎的發(fā)育情況，對(duì)出現(xiàn)特異表型的個(gè)體進(jìn)行基因型分析，以確定此種表型是否為純合突變體對(duì)應(yīng)的表型。

2 結(jié)果與分析

2.1 文昌魚Hh基因的突變率

TALEN mRNA顯微注射的卵受精發(fā)育至神經(jīng)胚(F0)后，經(jīng)PCR-酶切鑒定，結(jié)果顯示，Hh TALEN注射組胚胎提取的DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物中，有未切開的完整條帶，而對(duì)照組胚胎提取的DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物被 BsrGⅠ限制酶完全切開(圖 1)。根據(jù)未切開的電泳條帶占所有電泳條帶熒光亮度的百分比，估測(cè)注射 TALEN mRNA后 Hh基因的突變效率約為34%。在此基礎(chǔ)上，用同樣的方法重復(fù)注射了幾批文昌魚卵，受精后精心飼養(yǎng)，以獲取較多Hh基因敲除的F0代。

2.2 F0代的配子篩選結(jié)果

F0代群體生長(zhǎng)發(fā)育成熟后，逐尾誘導(dǎo)獲取配子。用PCR-酶切方法檢測(cè)了11尾F0所產(chǎn)配子，其中雄性10尾，雌性1尾，發(fā)現(xiàn)10號(hào)雄性成體的配子存在突變，將未能切開的DNA片段經(jīng)克隆測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示測(cè)序的3個(gè)克隆均為8 bp缺失突變(圖2)。

圖1 Hh TALEN文昌魚胚胎DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的BsrGⅠ酶切結(jié)果

圖2 以F0代10號(hào)個(gè)體所產(chǎn)配子DNA為模板的PCR產(chǎn)物酶切和測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

2.3 F1代亞成體的檢測(cè)

將F0代10號(hào)雄性個(gè)體與野生型雌性個(gè)體雜交，得到攜帶8 bp缺失突變的F1代群體。F1代群體生長(zhǎng)至亞成體(體長(zhǎng)約2 cm)時(shí)，即可逐尾檢測(cè)個(gè)體的Hh基因是否突變。共檢測(cè)了176尾，結(jié)果有8尾攜帶突變基因，突變類型與 F0代 10號(hào)雄性個(gè)體的配子相同(圖3)。

2.4 F2代純合突變體鑒定

將 F1代雜合子相互配對(duì)，獲得 F2代群體。在F2代幼體早期(受精后約 30 h)群體中觀察到一些尾部彎曲畸形幼體(圖4B)，于是挑取約200枚此種畸形的幼體混合為一組提基因組 DNA，同時(shí)還從 F2群體中選取約200枚外部形態(tài)正常的幼體(圖4 A)作為對(duì)照。經(jīng)PCR-酶切檢驗(yàn)，結(jié)果顯示外部形態(tài)正常幼體的PCR產(chǎn)物能夠部分切開，尾部彎曲畸形幼體的PCR產(chǎn)物完全不能切開(圖4C)，表明尾部彎曲畸形的幼體是純合子突變體，而外形正常的個(gè)體可能為野生型和雜合子突變體的混合群體。

在胚胎發(fā)育至神經(jīng)胚晚期之前的F2代群體中，未見任何發(fā)育異常個(gè)體，但此后Hh基因敲除的個(gè)體發(fā)育出現(xiàn)畸形。為此，本文將同一對(duì)親本產(chǎn)的胚胎在神經(jīng)胚期隨機(jī)分成3組獨(dú)立培養(yǎng)，每組150枚，以排除飼養(yǎng)管理的影響，待純合突變幼體發(fā)育至出現(xiàn)尾部彎曲的畸形性狀時(shí)，計(jì)數(shù)體形正常和尾部彎曲個(gè)體數(shù)。結(jié)果顯示，3組中外部形態(tài)正常幼體與尾部彎曲幼體的個(gè)數(shù)比值均接近 3:1(表 1)。此外，利用 PCR-酶切方法抽樣檢測(cè)了外部形態(tài)正常的幼體，結(jié)果顯示，在隨機(jī)檢測(cè)的 71尾中，雜合子 46尾和野生型25尾，2種基因型個(gè)體數(shù)量接近 2:1。以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，本研究獲得的文昌魚8 bp突變Hh基因符合孟德爾遺傳學(xué)分離定律，幼體尾部彎曲個(gè)體是Hh基因8 bp缺失突變純合子。

圖3 F1代Hh基因缺失突變檢測(cè)結(jié)果

圖4 F2代幼體形態(tài)及基因型檢測(cè)

表1 基因敲除F1雜合子配對(duì)所得F2代的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.5 純合突變體表型

當(dāng) Hh純合突變體的胚胎發(fā)育至神經(jīng)胚即將結(jié)束時(shí)，尾端開始出現(xiàn)彎曲(圖 5：A、B)，進(jìn)一步發(fā)育至幼體早期畸形特征更顯著(圖 5：C、D)，軀體前端和尾端均向腹側(cè)彎曲，脊索前端的腹面中胚層組織發(fā)育不全，致使表皮細(xì)胞層直接附于其上，口和鰓沒有發(fā)育。胚胎發(fā)育至幼體中期時(shí)，純合突變體尾部進(jìn)一步彎曲呈卷盤狀(圖5：F、G)，依然沒有口出現(xiàn)，咽鰓區(qū)發(fā)育異常，本該出現(xiàn)在右側(cè)的鰓裂卻出現(xiàn)在身體的腹中線處，鰓裂前端的內(nèi)柱也同樣出現(xiàn)在腹中線，而本來只出現(xiàn)在左側(cè)的口前窩卻在左右兩側(cè)各形成一個(gè)，使本該兩側(cè)不對(duì)稱的幼體變得左右對(duì)稱(圖 5：F～J)。隨著幼體繼續(xù)發(fā)育，純合突變體身體前、后兩端的彎曲進(jìn)一步加深，軀體縮小并伴全身嚴(yán)重水腫，咽區(qū)鰓裂結(jié)構(gòu)不能分辨(圖5：K、L)，因無口不能進(jìn)食，雖有腸道但無食物，純合突變體自受精約10 d后死亡，而此時(shí)的野生型和雜合子個(gè)體均正常發(fā)育并出現(xiàn)第4鰓裂。

圖5 Hh純合突變體的外部形態(tài)

3 討 論

基因敲除是研究特定基因功能的最直接的技術(shù)手段，不僅可以通過對(duì)功能缺失突變體的直接觀察，判斷該基因在胚胎發(fā)育過程中的作用，還可以用基因拯救(Rescue)等方法對(duì)基因功能進(jìn)行更深入的研究，因此獲得可傳代的基因敲除突變體是深入研究基因功能的關(guān)鍵性一步。Hedgehog是動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過程中的重要調(diào)控因子，本文報(bào)道的文昌魚Hh基因缺失突變體是在頭索動(dòng)物中首次獲得，該突變體能夠以雜合子的方式保存Hh基因缺失突變，這是文昌魚中報(bào)道的第一例基因敲除突變體。

3.1 文昌魚Hh基因缺失對(duì)胚胎發(fā)育左右對(duì)稱性的影響

文昌魚幼體在形態(tài)上有一個(gè)顯著的特點(diǎn)是咽鰓區(qū)呈左右不對(duì)稱分布，即左側(cè)開口，右側(cè)為鰓裂，此外位于口前方的口前窩也出現(xiàn)在身體左側(cè)，位于鰓裂前的內(nèi)柱同樣位于右側(cè)。本研究中我們觀察到，Hh純合突變體幼體的咽鰓區(qū)的結(jié)構(gòu)呈對(duì)稱分布，雖然口缺失，但在體左右各形成一個(gè)口前窩，使得鰓裂和內(nèi)柱被擠壓至腹側(cè)中央，表明Hh與文昌魚幼體發(fā)育的左右不對(duì)稱有關(guān)，Hh基因功能缺失后，幼體便失去了保持正常的左右不對(duì)稱發(fā)育的能力。

早在1995年Levin等[8]對(duì)雞胚的研究即已發(fā)現(xiàn)，Shh在雞胚亨氏結(jié)中只表達(dá)在左側(cè)，并可調(diào)控nodal基因的表達(dá)，因此推測(cè)Shh參與了雞胚左右不對(duì)稱的形成。Zhang等[15]對(duì)Hedgehog信號(hào)通路的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠中該通路成員之一的Smo突變可導(dǎo)致心管的右旋環(huán)化紊亂，分子檢測(cè)結(jié)果表明Hh信號(hào)通路可能間接地參與小鼠左右不對(duì)稱狀態(tài)的維持。本文敲除文昌魚Hh基因，結(jié)果導(dǎo)致幼體咽鰓區(qū)不再呈現(xiàn)左右不對(duì)稱分布，由此可見，在頭索動(dòng)物文昌魚中 Hh基因即已涉及個(gè)體發(fā)育過程中正常的不對(duì)稱構(gòu)造形成，但文昌魚中是否也像脊椎動(dòng)物那樣通過 Nodal信號(hào)通路間接影響不對(duì)稱的形成有待進(jìn)一步研究。

3.2 文昌魚Hh基因敲除突變體

文昌魚 Hh基因敲除純合突變體不僅在早期幼體階段咽鰓區(qū)的不對(duì)稱發(fā)育受到破壞，軀體的前端和尾端分別向腹面卷曲，而且幼體的口始終無法形成，最后全部死亡，可見該基因?qū)ξ牟~的存活必不可少，基因的缺失突變無法以純合子個(gè)體的形態(tài)保存下來。所幸的是敲除文昌魚 Hh基因后，從 F1代中篩選獲得的8尾攜帶Hh基因移碼突變的雜合子不僅能存活下來，而且還能繁殖，用這些F1雜合子自交后得到F2代群體，從中隨機(jī)取出450枚發(fā)育中的胚胎，分 3組培養(yǎng)至幼體期發(fā)現(xiàn)，發(fā)育正常與尾部畸形個(gè)體間的比例略大于3:1，其中畸形個(gè)體全部是純合突變體，之所以略偏離3:1，可能是因?yàn)闄z測(cè)時(shí)部分純合突變體已經(jīng)死亡，正常發(fā)育個(gè)體中應(yīng)當(dāng)有野生型與雜合子 2種基因型。為檢測(cè)雜合子的存活力是否受影響，本文還檢測(cè)了雜合子與野生型交配所產(chǎn)子代生長(zhǎng)發(fā)育至成體的基因型，共檢測(cè)了45尾，其中有11尾雜合子，34尾野生型，雖然偏離了1:1的比例，但是在每一對(duì)交配組合中仍然得到了相當(dāng)數(shù)量的生長(zhǎng)發(fā)育成熟的雜合子，因此本研究所得到的8 bp缺失突變文昌魚Hh基因可以雜合子形式保存下來，為隨后的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。檢測(cè)結(jié)果還提示雜合子的存活率顯著低于野生型，這一現(xiàn)象產(chǎn)生可以有兩種解釋：(1)由于雜合子體內(nèi)僅有1個(gè)正常的Hh基因，因此基因表達(dá)產(chǎn)物劑量減少，至使雜合子存活率降低；同時(shí)也可能由于該突變體是Hh基因8 bp缺失造成的移碼突變，基因突變后仍有可能表達(dá)出無功能的產(chǎn)物，該無功能產(chǎn)物對(duì)正?；虮磉_(dá)產(chǎn)物造成干擾或?qū)ε咛ブ苯赢a(chǎn)生其它不利影響，從而降低了雜合子存活率。(2)另一種可能是TALEN的副作用，但TALEN mRNA注射后的化學(xué)毒副作用和 TALEN的脫靶的副作用，都應(yīng)當(dāng)在F0代中表現(xiàn)出來，而不會(huì)在經(jīng)過2～3代繁殖后的子代中出現(xiàn)；如果設(shè)想脫靶效用造成非目標(biāo)基因修飾可以同時(shí)傳遞到子代中，從本文設(shè)計(jì)的突變體篩選策略中可以看出，同時(shí)具有Hh和非目標(biāo)基因修飾并被篩出的可能性也基本為 0。由此分析可見，雜合子存活率低可能是Hh基因本身的原因，其產(chǎn)生的機(jī)制隨著該基因功能研究的深入將會(huì)得到更好的解釋。

[1] Nüsslein-Volhard C, Wieschaus E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature, 1980, 287(5785): 795-801.

[2] Huangfu D, Anderson KV. Signaling from Smo to Ci/Gli: conservation and divergence of Hedgehog pathways from Drosophila to vertebrates. Development, 2006, 133(1): 3-14.

[3] Chiang C, Litingtung Y, Lee E, Young KE, Corden JL, Westphal H, Beachy PA. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature, 1996, 383(6599): 407-413.

[4] Ingham PW, Kim HR. Hedgehog signalling and the specification of muscle cell identity in the zebrafish embryo. Exp Cell Res, 2005, 306(2): 336-342.

[5] Riddle RD, Johnson RL, Laufer E, Tabin C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell, 1993, 75(7): 1401-1416.

[6] Bertrand S, Escriva H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development, 2011, 138(22): 4819-4830.

[7] Shimeld SM. The evolution of the hedgehog gene family in chordates: insights from amphioxus hedgehog. Dev Genes Evol, 1999, 209(1): 40-47.

[8] Levin M, Johnson RL, Sterna CD, Kuehn M, Tabin C. A molecular pathway determining left-right asymmetry in chick embryogenesis. Cell, 1995, 82(5): 803-814.

[9] Li G, Feng J, Lei Y, Wang J, Wang H, Shang LK, Liu DT, Zhao H, Zhu Y, Wang YQ. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri Using TALEN method. J Genet Genomics, 2014, 41(4): 215-219.

[10] Zhang QJ, Sun Y, Zhong J, Li G, Lü XM, Wang YQ. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J Exp Zool B Mol Dev Evol, 2007, 308(4): 464-472.

[11] Li G, Shu ZH, Wang YQ. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One, 2013, 8(9): e75461.

[12] Cermak T, Doyle EL, Christian M, Wang L, Zhang Y, Schmidt C, Baller JA, Somia NV, Bogdanove AJ, Voytas DF. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res, 2011, 39(12): e82.

[13] Liu X, Li G, Feng J, Yang X, Wang YQ. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev Genes Evol, 2013, 223(4): 269-278.

[14] 張秋金. 廈門海域文昌魚屬Branchiostoma的分類及2種文昌魚的實(shí)驗(yàn)室連續(xù)繁育[學(xué)位論文]. 廈門大學(xué), 2007.

[15] Zhang XM, Ramalho-Santos M, McMahon AP. Smoothened mutants reveal redundant roles for Shh and Ihh signaling including regulation of L/R asymmetry by the mouse node. Cell, 2001, 105(6): 781-792.

(責(zé)任編委: 張博)

Generating amphioxus Hedgehog knockout mutants and phenotype analysis

Hui Wang, Guang Li, Yiquan Wang
School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China

The amphioxus is a promising animal model for evolutionary-developmental studies due to its key position on the animal phylogenetic tree. In the present study, we reported a genetically modified amphioxus strain on the Hedgehog (Hh) gene locus using the TALEN method. The result showed that our TALEN pair injection could bring about 34% mutations in the amphioxus Hh coding region. Further analysis on the F0gametic DNA revealed that the mutations had entered into gametes. So, we paired one F0male carrying an 8 bp deletion with a wild-type (WT) female, and carefully nursed the F1embryos up to adulthood. We then screened F1individually via analyzing their genomic DNA from a tiny tail tip, and obtained eight heterozygous mutants from the F1offspring. Moreover, our observation on the F2embryos generated by mating F1mutants also revealed that about 25% of early larvae developed aberrantly with head and tail curving ventrally, agenesis of the mesoblastic tissue under their anterior notochord, and no mouth opening. With the larva growth, deformities (such as twist of head and tail, mouth absent, ventrally localized endostyle and gill slits) became more severe, and eventually those malformed larvae died due to no food intake.Genetic analysis showed that all these deformed embryos were homozygous mutants and the ratio of Hh hetorozygotes vs WT agreed with Mondel's law. WT amphioxus larvae are asymmetric with the mouth on the left and gill slits on the right side. However, the homozygous mutant larvae became left-right symmetric with the gill slits on the ventral side, indicating a conserved role of Hedgehog signaling in establishing the left-right embryonic axis.

TALEN; gene knockout; amphioxus; hedgehog gene; mutant

2015-06-10;

2015-07-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31372188，31101631) 資助

王慧，碩士，專業(yè)方向：動(dòng)物發(fā)育遺傳。E-mail: 1337477106@qq.com

王義權(quán)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物分子遺傳。E-mail: wangyq@xmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-276

時(shí)間:2015-7-24 10:31:31

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150724.1031.002.html