王士超 劉煜德 王 嵩 吳 輝 楊 磊 劉 芳 龔兆會(huì) 周小雄 葉桃春 李 榮 吳 偉

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣東 廣州 510405；3.廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院共和院區(qū)，廣東 廣州 510080）

·研究報(bào)告·

中藥復(fù)方補(bǔ)腎益心片對(duì)高血壓大鼠血壓、勃起功能及ACE2-Ang（1-7）-MAS軸的干預(yù)作用*

王士超1劉煜德1王 嵩1吳 輝1楊 磊2劉 芳3龔兆會(huì)1周小雄1葉桃春1李 榮1吳 偉1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣東 廣州 510405；3.廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院共和院區(qū)，廣東 廣州 510080）

目的觀察補(bǔ)腎益心片對(duì)高血壓大鼠（SHR）血壓的影響和對(duì)其勃起功能、一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）及Ang（1-7）的作用。方法將原發(fā)性高血壓雄性大鼠分為3組，補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組、模型對(duì)照組。治療4周后，檢測(cè)血漿和腹主動(dòng)脈組織內(nèi)NOS、NO濃度以及血漿Ang（1-7）濃度。用尾動(dòng)脈測(cè)壓儀測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，頸部皮下注射阿樸嗎啡（APO）記錄其陰莖勃起次數(shù)以檢測(cè)大鼠的勃起功能。結(jié)果補(bǔ)腎益心片及纈沙坦均可提高腹主動(dòng)脈組織內(nèi)NO含量，提高血漿Ang（1-7）含量，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組治療后血壓都明顯降低，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組勃起次數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論補(bǔ)腎益心片可以降低SHR的收縮壓。補(bǔ)腎益心片補(bǔ)腎益心片可以改善SHR的勃起功能。補(bǔ)腎益心片可增加SHR腹主動(dòng)脈NO含量及血漿Ang（1-7）含量。

補(bǔ)腎益心片 自發(fā)性高血壓大鼠 高血壓 勃起功能 ACE2-Ang（1-7）-MAS軸

高血壓以動(dòng)脈血壓升高為主要表現(xiàn)，發(fā)病率逐年增高，且并發(fā)癥較為多見。中醫(yī)藥治療高血壓副作用少，安全性高，具有西藥不可替代的優(yōu)勢(shì)。高血壓病根據(jù)其臨床特點(diǎn)屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等病范疇。補(bǔ)腎益心片是本課題組在陳宏珪教授指導(dǎo)下，結(jié)合中醫(yī)傳統(tǒng)理論、臨床經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究成果確定組方，并制成片劑應(yīng)用于臨床。該方由淫羊藿和車前子組成，淫羊霍性溫，具補(bǔ)腎壯陽之功；車前子性寒，具有清肝、利水等作用。兩藥合用，一溫一寒，一補(bǔ)一清，具有補(bǔ)腎清肝的功效，針對(duì)降壓西藥引起勃起功能障礙（ED）等不良反應(yīng)有很好的臨床療效。前期研究表明，補(bǔ)腎益心方對(duì)輕中度高血壓的降壓作用和高血壓性ED療效滿意，其降壓機(jī)制可能與促進(jìn)一氧化氮（NO）合成和分泌、利尿作用等有關(guān)；該方對(duì)輕中度高血壓的降壓作用和高血壓性ED療效滿意［1-5，7-11］。為觀察自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的勃起功能及陰莖勃起功能的變化，探討高血壓引起勃起功能障礙（ED）的可能原因；驗(yàn)證探索中藥補(bǔ)腎益心片對(duì)SHR的血壓和勃起功能的干預(yù)作用，筆者進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10周齡SPF級(jí)SHR大鼠雄性23只，體質(zhì)量150~180 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑儀器 補(bǔ)腎益心片由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，每片相當(dāng)于生藥5 g，由淫羊藿、車前子等組成，每片相當(dāng)于生藥5 g。陽性對(duì)照藥纈沙坦由北京諾華制藥有限公司提供，80 mg/粒。Rat Ang-（1-7）ELISA Kit由上海浩本生物科技有限公司分裝（批號(hào)BPE36118）。阿樸嗎啡（APO）50 μL購(gòu)買自廣州外顯子生物技術(shù)有限公司。臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)TG-16W），VIS-721可見光分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂BIO-RAD，型號(hào)iMARK），上海奧爾科特ALC-NIBP大鼠尾動(dòng)脈測(cè)壓儀系統(tǒng)。

1.3 分組與給藥 所有的大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，稱重，藥物干預(yù)前尾動(dòng)脈測(cè)壓，經(jīng)測(cè)量證實(shí)為高血壓大鼠。將SHR大鼠按隨機(jī)表隨機(jī)分為3組，各組分別予以相應(yīng)處理。（1）補(bǔ)腎益心片（中藥復(fù)方）組共8只，予以補(bǔ)腎益心片10片，溶于0.9%氯化鈉注射液5 mL中，每只予以灌胃1 mL，按照25 g/kg（約成人用量的20倍）予以灌胃，每日1次，持續(xù)4周。（2）纈沙坦（西藥）組共8只，予以纈沙坦（代文）80 mg/粒，溶于0.9%氯化鈉注射液28 mL中，每只予以灌胃2 mL，按照4 mg/kg（成人用量的20倍）予以灌胃，每日1次，持續(xù)4周。（3）模型對(duì)照組共7只，常規(guī)飼養(yǎng)，予0.9%氯化鈉注射液灌胃，每只予以灌胃2 mL，每日1次，持續(xù)4周。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 藥物干預(yù)后，每周均無創(chuàng)監(jiān)測(cè)血壓及勃起功能測(cè)定。測(cè)量大鼠血壓變化，采用夾尾法測(cè)量大鼠收縮壓，用大鼠尾動(dòng)脈測(cè)壓儀測(cè)定大鼠清醒狀態(tài)下的尾動(dòng)脈血壓。將大鼠置于儀器配套的固定籠中，置30℃恒溫箱預(yù)熱15 min，待大鼠安靜后將鼠尾套袖放置于鼠尾的根部進(jìn)行測(cè)量，出現(xiàn)的第1個(gè)血壓波即為收縮壓。大鼠性活動(dòng)觀察，勃起功能測(cè)定方法：采用Heaton方法進(jìn)行。小劑量頸部皮下注射100 μg/kg APO可引起正常大鼠100%的陰莖勃起，作為評(píng)價(jià)大鼠陰莖勃起功能的指標(biāo)。每只大鼠注射APO后觀察30 min，陰莖頭充血及末端陰莖體露出為勃起1次，記錄每只大鼠陰莖勃起次數(shù)和每組大鼠的勃起率。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)束時(shí)麻醉大鼠，局部消毒后切開胸腔，以靜脈采血針穿刺心臟取血并分離剪下主動(dòng)脈。在室溫下，血液經(jīng)離心后取上清，置于干凈離心管中，-20℃保存。采用BCA蛋白定量法分別測(cè)定大鼠血漿、腹主動(dòng)脈組織一氧化氮合酶（NOS）、NO含量；采用ELISA法檢測(cè)血漿Ang-（1-7）含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示，各組間單因素方差分析檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥物干預(yù)對(duì)各組血壓影響的比較 見表1。模型對(duì)照組治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組治療后血壓都明顯降低（P＜0.01），補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組治療后與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示補(bǔ)腎益心片具有降壓作用。治療后補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組血壓組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 藥物干預(yù)前后對(duì)各組SHR血壓影響的比較（mmHg，±s）

表1 藥物干預(yù)前后對(duì)各組SHR血壓影響的比較（mmHg，±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05；與纈沙坦組比較，△P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，▲P＜0.05。下同

組別 n 干預(yù)前 干預(yù)后補(bǔ)腎益心片組 8 2 0 6 . 1 3 ± 1 1 . 3 9 1 7 8 . 6 3 ± 1 0 . 7 5*▲△纈沙坦組 8 2 0 4 . 6 7 ± 1 3 . 2 6 1 6 4 . 5 2 ± 1 2 . 0 9*▲模型對(duì)照組 7 2 1 0 . 3 7 ± 1 0 . 7 3 2 0 6 . 3 7 ± 1 1 . 5 8

2.2 藥物干預(yù)對(duì)各組SHR性活動(dòng)（勃起功能）影響的比較 見表2。治療后補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組勃起次數(shù)明顯增多，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。治療后補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示補(bǔ)腎益心片具有確切的改善勃起功能作用。

表2 藥物干預(yù)對(duì)各組SHR大鼠性活動(dòng)（勃起功能）影響的比較（次，±s）

表2 藥物干預(yù)對(duì)各組SHR大鼠性活動(dòng)（勃起功能）影響的比較（次，±s）

組別 n 干預(yù)前 干預(yù)后補(bǔ)腎益心片組 8 0 . 5 ± 0 . 7 2 . 1 ± 0 . 5*▲纈沙坦組 8 0 . 7 ± 0 . 3 2 . 4 ± 0 . 6*▲模型對(duì)照組 7 0 . 6 ± 0 . 5 0 . 6 ± 0 . 7*

2.3 藥物干預(yù)對(duì)各組NOS影響的比較 見表3。血漿及腹主動(dòng)脈NOS含量數(shù)值顯示，各組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 藥物干預(yù)對(duì)各組NOS影響的比較（±s）

表3 藥物干預(yù)對(duì)各組NOS影響的比較（±s）

組別 n 血漿 腹主動(dòng)脈補(bǔ)腎益心片組 8 9 . 0 5 7 ± 2 . 9 2 4 1 9 . 1 0 5 ± 6 . 5 7 1纈沙坦組 8 6 . 0 5 3 ± 4 . 3 0 4 1 7 . 6 8 8 ± 9 . 4 5 8模型對(duì)照組 7 1 1 . 6 3 7 ± 4 . 6 8 7 1 8 . 8 8 7 ± 2 . 2 0 9

2.4 藥物干預(yù)對(duì)各組NO影響的比較 表4。血漿及腹主動(dòng)脈NO含量數(shù)值顯示，補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01或P＜0.05），提示補(bǔ)腎益心片具有降壓作用。治療后補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 藥物干預(yù)對(duì)各組NO影響的比較（±s）

表4 藥物干預(yù)對(duì)各組NO影響的比較（±s）

組別 n 血漿 腹主動(dòng)脈補(bǔ)腎益心片組 8 1 5 . 5 0 0 ± 4 . 3 7 5 3 5 . 6 0 4 ± 7 . 5 0 5*▲△纈沙坦組 8 1 5 . 3 3 3 ± 2 . 3 0 9 2 1 . 5 3 7 ± 1 3 . 4 8 4*▲模型對(duì)照組 7 2 6 . 0 0 0 ± 2 . 8 2 8 1 7 . 4 3 7 ± 1 1 . 6 4 9

2.5 藥物干預(yù)前后對(duì)Ang（1-7）的影響 見表5。補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組分別與模型對(duì)照組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），補(bǔ)腎益心片組、纈沙坦組兩者比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 藥物干預(yù)前后對(duì)Ang（1-7）數(shù)值的影響（±s）

表5 藥物干預(yù)前后對(duì)Ang（1-7）數(shù)值的影響（±s）

組別 n 血漿補(bǔ)腎益心片組 8 4 5 . 5 4 2 ± 1 2 . 7 2 6▲纈沙坦組 8 4 3 . 4 9 1 ± 7 . 7 0 8▲模型對(duì)照組 7 2 5 . 5 2 1 ± 2 . 7 2 7

3 討 論

高血壓是臨床常見的心血管疾病，發(fā)病率高，引起靶器官損害后致殘致死率高，嚴(yán)重威脅人類健康。該病患病率呈逐漸上升的趨勢(shì)?！吨袊?guó)高血壓防治指南2010年版》［1］指出：2002年調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)18歲以上成人高血壓患病率為18.8%。而對(duì)高血壓的知曉率只有30.2%，治療率只有24.7%，控制率只有6.1%，這表明我國(guó)高血壓的防治工作任重道遠(yuǎn)。高血壓患者ED發(fā)病率遠(yuǎn)高于一般人群［2］，男性高血壓人群同時(shí)患ED者達(dá)55.5%［3］，老年男性高血壓患者ED患病率更高達(dá)95.1%［4］，經(jīng)治療的高血壓患者ED發(fā)生率高于未經(jīng)治療者［2］，這與多種降壓藥可引起和（或）加重ED有關(guān)［5］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)高血壓主要是采用利尿劑、β-受體阻滯劑、鈣拮抗劑、腎素-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）類藥物等來治療。這些藥物雖有較好的降壓作用，但有較明顯的副作用，尚有不足之處。抗高血壓藥物可以引起ED，以利尿藥和β受體阻滯劑最為明顯，而有報(bào)道認(rèn)為ARB和ACEI有助于改善高血壓引起的ED，這在增加抗高血壓藥物使用的依從性和改善生活質(zhì)量上具有積極意義［6］。

SHR是高血壓實(shí)驗(yàn)研究中最常用的模型，與人原發(fā)性高血壓發(fā)病、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有著比較相似的特征。SHR在疾病發(fā)展階段也形成典型的高血壓心血管病變［12］。病證結(jié)合的動(dòng)物模型對(duì)中醫(yī)藥的基礎(chǔ)研究顯得非常重要，要求該模型疾病和證候穩(wěn)定、均一、可重現(xiàn)。SHR作為自發(fā)性高血壓模型，符合疾病的穩(wěn)定和均一性，是建立病癥結(jié)合的動(dòng)物模型的理想途徑。大鼠交配實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用于雄鼠的性行為評(píng)價(jià)及其機(jī)制探討，是評(píng)價(jià)性功能的經(jīng)典指標(biāo)［13］。SHR情緒較為緊張，小便偏黃量少，大便顆粒小而干，眼突明顯，心率快，痛覺敏感，綜合這些行為學(xué)特征和體征，通過觀察臨床高血壓患者表現(xiàn)的眩暈頭痛、面紅目赤、煩躁易怒、便干尿赤的特征，初步判定該動(dòng)物模型早期的高血壓癥狀類似中醫(yī)學(xué)中肝腎虧虛、肝火亢盛證型特征［14］。現(xiàn)代人過食肥甘厚味，損傷脾胃，引起熱盛傷陰，可發(fā)展成肝腎虧虛，陰虛陽亢證［15］。高血壓可以引起ED，這在臨床實(shí)踐和動(dòng)物模型中都得到了證實(shí)。此前已有實(shí)驗(yàn)研究表明，高血壓嚴(yán)重影響自發(fā)性高血壓大鼠的陰莖勃起功能，海綿體組織超微結(jié)構(gòu)的病理改變可能是SHR勃起功能下降的機(jī)理之一［16］。高血壓損害了大鼠的性欲和性喚醒能力。本研究結(jié)果顯示，血漿NO含量，模型對(duì)照組組高于藥物干預(yù)組；而補(bǔ)腎益心片可提高腹主動(dòng)脈組織中的NO含量，優(yōu)于纈沙坦組及模型對(duì)照組。補(bǔ)腎益心片與纈沙坦均可提高血漿中Ang（1-7）含量，優(yōu)于0.9%氯化鈉注射液對(duì)照，但補(bǔ)腎益心片組與纈沙坦組之間無顯著性差異。

本研究從ACE2-Ang（1-7）-MAS軸的角度研究補(bǔ)腎益心片對(duì)高血壓大鼠的影響，以血漿Ang（1-7）值為觀察指標(biāo)，有助于闡明其用于治療高血壓的微觀機(jī)制，為臨床運(yùn)用該方防治高血壓提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；有助于促進(jìn)中藥在高血壓防治領(lǐng)域的運(yùn)用，并為今后進(jìn)一步研究可能通過調(diào)控ACE2-Ang（1-7）-Mas軸，具有保護(hù)心腎等靶器官作用的中藥新藥研究奠定基礎(chǔ)。在以后的工作中，要進(jìn)一步研究中藥復(fù)方改善高血壓性ED和拮抗降壓藥所致ED的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥在高血壓防治領(lǐng)域的運(yùn)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of TCM Compound Bushenyixin Tablet on Blood Pressure，Erectile Function and ACE2-Ang（1-7）-MAS Axis of Spontaneously Hypertensive Rat

WANG Shichao，LIU Yude，WANG Song，et al.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM，Guangdong，Guangzhou 510405，China

Objective：To study the variation of the level of NOS，NO and Ang（1-7）in Spontaneously Hypertensive Rat（SHR）.Methods：SHR were divided randomly into 3 groups：Bushenyixin group（n=8），valsartan group（n=8），and model group（n=7）.Each group was given Bushenyixin tablet，valsartan，and saline by gavages respectively.After 4 weeks，the concentration of NOS，NO，Ang（1-7）in plasma and the concentration of NOS，NO in aorta were observed.Rat tail artery systolic pressure was measured by the tail arterial pressure measurement，and subcutaneous injection of apomorphine（APO）were taken to record times of the penile erection erectile to assess the function detection in rats.Results:The concentration of NO in plasma was significantly lower in the Bushenyixin group than for model group.The concentration of NO in aorta and Ang（1-7）in plasma was significantly higher in the Bushenyixin group than in the model group.The concentration of NO in aorta was significantly higher in Bushenyixin group than in the valsartan group.Bushenyixin tablet group，valsartan group after treatment，the blood pressure decreased obviously，there was significant difference compared with those before treatment.After the treatment of Bushenyixin tablet group，valsartan group erectile number increased obviously，there was significant difference（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Bushenyixin tablet can reduce SHR′s systolic pressure.Bushenyixin table can improve SHR′s erectile function.Bushenyixin tablet had effects of increasing of NO level in aorta and Ang（1-7）level in plasma in SHR.

Bushenyixin tablet；Spontaneously Hypertensive Rat；Hypertension；erectile function；ACE2-Ang（1-7）-MAS axis

R285.5

A

1004-745X（2015）02-0204-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.02.006

2014-12-01）

廣東省教育廳課題資助項(xiàng)目（粵財(cái)教［2010］275號(hào)）