（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽 110001）

人乳頭瘤病毒感染在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的表達及臨床意義

計早，韓佳利，閻艾慧

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽 110001）

目的探討人乳頭瘤病毒（HPV）感染在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤（NIP）中的表達及意義，為臨床治療提供可靠的科學依據(jù)。方法應用聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)對54例原發(fā)組、26例復發(fā)組及24例惡變組NIP標本進行HPV 11、16及18檢測分析。結(jié)果惡變組高危型HPV感染率明顯高于原發(fā)組和復發(fā)組（P＜0.01），復發(fā)組高危型HPV感染率明顯高于原發(fā)組（P＜0.05）；原發(fā)組和復發(fā)組中，高危型HPV感染者多數(shù)存在局部上皮中重度異型增生或局部細胞增生活躍；發(fā)生于鼻腔外側(cè)壁組高危型HPV感染率均高于上頜竇、篩竇及額竇組（P＜0.05）。結(jié)論檢測高危型HPV16/18在NIP中的表達狀況對NIP的治療及判斷復發(fā)和惡變可能具有重要的臨床應用價值。

鼻；內(nèi)翻乳頭狀瘤；人乳頭瘤病毒；聚合酶鏈式反應

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一類特異感染人皮膚、黏膜的共價雙鏈環(huán)狀DNA病毒［1，2］。近年來，HPV感染對頭頸部腫瘤的影響受到國內(nèi)外學者的關(guān)注。鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤（nasal inverted papilloma，NIP）是一種發(fā)生于鼻腔鼻竇黏膜的上皮組織腫瘤，其病理組織學雖為良性，但具有侵襲性生長、局部破壞強、復發(fā)率和惡變率高等特征。NIP病因和發(fā)病機制尚未完全清楚，近來有學者報道HPV感染與NIP發(fā)病密切相關(guān)［3，4］，但其HPV亞型感染與臨床分組及與病變特點的關(guān)系尚未見報道。本研究應用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)對收集的NIP病例標本中HPV亞型11、16及18進行檢測分析，旨在探討HPV各亞型感染與NIP復發(fā)、惡變及病變特點的關(guān)系，以進一步提高臨床診治水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料：收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科2007年4月至2012年8月期間手術(shù)切除的NIP新鮮組織標本104例。患者年齡21～80歲，平均51.35歲；男64例，女40例。病變發(fā)生部位：上頜竇52例，篩竇22例，鼻腔外側(cè)壁20例，額竇10例。根據(jù)發(fā)病情況分為原發(fā)組（n=54）、復發(fā)組（n=26）、惡變組（n=24）。

1.1.2 主要試劑：2×Taq PCR MasterMix、組織基因組DNA提取試劑盒和DNA Marker-DL2000均購自北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖購自法國Biowest公司。

1.2 方法

按DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA（步驟略），選用HPV 11、16和18共4對引物，由TIANGEN公司設(shè)計合成，序列如下：HPV-11：R-5′GGAATACATGCGCCATGTGG 3′，F(xiàn)-5′CGAGCAGA CGTCCGTCCTCG 3′；HPV-16：R-5′AGCTCAGAGG AGGAGGATGA 3′，F(xiàn)-5′GGTTTCTGAGAACAGATG GG 3′；HPV-18：R-5′GAGCCCCAAAATGAAATTCC 3′，F(xiàn)-5′CAAAGGACAGGGTGTTCAGA 3′。

PCR反應體系：總體積25 μL，模板DNA 2 μL，引物R和F各1μL，MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增條件如下：HPV6、16和18分別進行94℃預變性3 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃1 min，共循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min，3對引物的退火溫度均為62℃。HPV11引物進行95℃預變性5 min，95℃變性1 min，64℃退火1.5 min，72℃2 min，共循環(huán)35次，最后72℃延伸3 min。

取10 μL PCR產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，160 V電壓下電泳30 min。在紫外投射燈下觀察結(jié)果并照相，HPV6、11、16和18四個亞型的擴增片段大小分別為280 bp、360 bp、203 bp、244 bp。每個亞型各選取1份顯影較好的PCR產(chǎn)物于上海生工公司測序，并以此作為陽性對照。

1.3 統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。HPV-DNA表達在不同組間的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各臨床組NIP中HPV DNA的表達結(jié)果

惡變組HPV感染率（91.66%）明顯高于原發(fā)組（51.85%）（P＜0.01），但與復發(fā)組感染率（73.08%）相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），而惡變組高危型HPV感染率（91.66%）明顯高于原發(fā)組（7.40%）和復發(fā)組（23.08%）（P＜0.01）。

原發(fā)組與復發(fā)組之間盡管HPV感染率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但復發(fā)組內(nèi)高危型HPV感染率（23.08%）明顯高于原發(fā)組（7.40%）（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 各臨床組NIP中HPV DNA的表達結(jié)果Tab.1 The expression of HPV DNA in NIP in each clinical group

2.2 良性病變組高危型HPV感染者的病變特點

查閱原始病理報告，發(fā)現(xiàn)原發(fā)組中高危型HPV感染的4例中有2例為局部上皮中重度異型增生；復發(fā)組中高危型HPV感染的6例中有3例為局部上皮中重度異型增生，2例為局部細胞增生活躍。

2.3 不同病變部位NIP中HPV DNA的表達結(jié)果

發(fā)生于上頜竇、鼻腔外側(cè)壁、篩竇及額竇各部位HPV的總感染率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但鼻腔外側(cè)壁NIP中高危型HPV感染率（80.00%）高于上頜竇（28.85%）、篩竇（9.09%）及額竇NIP（20.00%）（P＜0.05）。見表2。

表2 不同部位NIP中HPV DNA的表達結(jié)果Tab.2 The expression of HPV DNA in NIP in different sites

3 討論

NIP約占鼻部腫瘤的0.5%～4%，占鼻部乳頭狀瘤的79%，其復發(fā)率高達25%～75%，大約10%～15%的患者同時伴有或日后惡變?yōu)轺[狀細胞癌［5］，但惡變原因目前尚不十分清楚。

HPV可感染人的皮膚和黏膜上皮細胞，引起多種良、惡性病變，依其致病性不同，將其分為高危和低危兩大類別：常見的低危型HPV 11感染細胞后，產(chǎn)生各種良性增生性病變；常見的高危型HPV16、18持續(xù)感染細胞后，可激活細胞原癌基因或使抗癌基因失活，最終誘發(fā)細胞癌變［6］。據(jù)統(tǒng)計，NIP臨床中惡變率為6%～13%，且多數(shù)惡變?yōu)轺[狀細胞癌。Klemi等［7］應用原位雜交方法發(fā)現(xiàn)2例NIP伴惡變者中檢出HPV16，第3例惡變者同時檢出HPV 11和16。盧山珊等［8］應用PCR技術(shù)檢測NIP組織中HPV -DNA的感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3例NIP惡變的患者中均為高危型HPV感染者，但良性NIP伴高危型HPV感染者是否與病變特點存在聯(lián)系尚不清楚。

本研究采用PCR方法對104例NIP病例標本進行HPV-DNA檢測，結(jié)果顯示：惡變組中HPV感染率明顯高于原發(fā)組（P＜0.01），但與復發(fā)組無差異（P＞0.05），而惡變組中的高危型HPV感染率明顯高于原發(fā)組和復發(fā)組（P＜0.01）。本結(jié)果提示單純采用HPV感染率判斷病變性質(zhì)并不全面，而應用高危型HPV感染率判斷病變性質(zhì)才更有說服力。因此，推論在NIP組織中檢出高危型HPV（特別是HPV16/ 18）時可能預示其惡變的風險增加。

NIP術(shù)后易復發(fā)是其重要的臨床特征，然而關(guān)于HPV感染對NIP復發(fā)的影響尚存在爭議。Beck等［9］認為NIP術(shù)后復發(fā)與HPV感染密切相關(guān)，而Kraft等［10］則得到相反的結(jié)論。本研究結(jié)果顯示：原發(fā)組與復發(fā)組之間HPV總感染率無差異（P＞0.05），但高危型HPV感染率存在明顯差異，復發(fā)組（23.08%）明顯高于原發(fā)組（7.40%，P＜0.01）。此外，本研究在良性病變組中意外地發(fā)現(xiàn)了也有高危型HPV感染者，并且多數(shù)與病變特點存在一定聯(lián)系，原發(fā)組中高危型HPV感染的4例中有2例為局部上皮中重度異型增生，復發(fā)組中高危型HPV感染的6例中有3例為局部上皮中重度異型增生，2例為局部細胞增生活躍，由此推斷高危型HPV感染可能與病變特點密切相關(guān)，這一點目前國內(nèi)外尚未見報道。同時也提示臨床醫(yī)生對這類病變施行手術(shù)時應擴大切除范圍，并密切隨訪病情。

盡管NIP屬良性腫瘤，但其特殊的生物學特性使其具有與一般良性腫瘤不同的鮮明特點，其主要特點為局部侵襲性生長，常破壞腫瘤周邊的骨質(zhì)，常侵襲鼻腔外側(cè)壁，但具體原因尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生于鼻腔外側(cè)壁組的高危型HPV感染率明顯高于上頜竇、篩竇及額竇組的感染率，提示局部呈侵襲性生長者很可能與高危型HPV持續(xù)感染有關(guān)，由于本研究的病例數(shù)較少，結(jié)論有待于今后進一步研究。

總之，應用PCR技術(shù)檢測NIP標本中高危型HPV DNA有助于預測NIP的復發(fā)及惡變傾向，臨床上對于原發(fā)型和復發(fā)型NIP應關(guān)注是否存在高危型HPV感染，尤其是伴有局部上皮異型增生、局部細胞異型增生及累及鼻腔外側(cè)壁者，應采用積極徹底的手術(shù)方案，并進行密切隨訪，關(guān)注術(shù)后臨床經(jīng)過。對于高危型HPV持續(xù)感染者，應給予適當?shù)母深A治療，祛除惡變風險因素。

［1］zur Hausen H.Papillomavirus infections--a major cause of human cancers［J］.Biochim Biophys Acta，1996，1288（2）：F55-F78.

［2］Bosch FX，Broker TR，F(xiàn)orman D，et al.Comprehensive control of human papillomavirus infections and related diseases［J］.Vaccine，2013，31（Suppl7）：H1-31.

［3］Lin H，Lin D，Xiong XS.Roles of HPV infection and Stathmin in the pathogenesis of sinonasal inverted papilloma［J］.Head Neck，2014，Sep 15［Epub ahead of print］.

［4］Syrj?nen K，Syrj?nen S.Detection of human papillomavirus in sinonasal papillomas：systematic review and meta-analysis［J］.Laryngoscope，2013，123（1）：181-192.

［5］Lawson W，Ho BT，Shaari CM，et al.Inverted papilloma：a report of 112 cases［J］.Laryngoscope，1995，105（3 Pt 1）：282-288.

［6］Milde-Langosch K，Riethdorf S，L?ning T.Association of human papillomavirus infection with carcinoma of the cervix uteri and its precursor lesions：theoretical and practical implications［J］.Virchows Arch，2000，437（3）：227-233.

［7］Klemi PJ，Joensuu H，Siivonen L，et al.Association of DNA aneuploidy with human papillomavirus-induced malignant transformation of sinonasal transitional papillomas［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，1989，100（6）：563-567.

［8］盧山珊，周韌，徐紀為.鼻腔及鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤與人乳頭狀瘤病毒感染及病毒亞的關(guān)系［J］.中華耳鼻咽喉科頭頸外科雜志，2005，40（3）：195-198.

［9］Beck JC，McClatchey KD，Lesperance MM，et al.Presence of human papilloma virus predicts of inverted papilloma［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，1995，113（1）：49-55.

［10］Kraft M，Simmen D，Casas R，et al.Significance of human papilloma virus in sinonasal papillomas［J］.Laryngol Otol，2001，115（9）：709-714.

（編輯王又冬）

Expression and ClinicalSignificance ofHuman Papillomavirus Infection in NasalInverted Papilloma

JIZao，HANJia-li，YANAi-hui
（DepartmentofOtolaryngology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the expression and significance of human papillomavirus（HPV）infection in nasal inverted papilloma（NIP），and provide reliable scientific basis for the clinical treatment.MethodsPolymerase chain reaction（PCR）technique was adopted to detect HPV 11，HPV 16 and HPV 18 in NIP samples in the primary group（n=54），the recurrentgroup（n=26）and the malignantgroup（n=24）.ResultsThe high-risk HPV infection rate was significantly higher in the malignant group than in the primary group and the recurrent group（P＜0.01）.The high-risk HPV infection rate was significantly higher in the recurrent group than in the primary group（P＜0.05）.In the primary group and the recurrent group，most patients with high-risk HPV infection had local moderate to severe epithelial hyperplasia or active hyperplasia of local cells.The infection rate of high-risk HPV which occurred in the lateral wall of nasal cavity was higher than that in the maxillary sinus，ethmoid sinus and frontalsinus（P＜0.05）.ConclusionThe detection ofexpression status ofhigh-risk HPV16/18 in NIP may have importantclinicalapplication value forNIP therapy and judgmentofrecurrence and malignancy.

nose；inverted papilloma；human papillomavirus；PCR

R739.62

A

0258-4646（2015）04-0323-04

遼寧省自然科學基金（2014020108-102）

計早（1987-），女，醫(yī)師，本科.

閻艾慧，E-mail：yah567@163.com

2015-01-15

網(wǎng)絡(luò)出版時間：