秦宇，趙江月，閔曉潔，羅文婷2，李晶，吳欣蔚，劉佳，閻啟昌，張勁松

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110005；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，沈陽 110004）

microRNA let-7a對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控及其在白內(nèi)障中的作用

秦宇1，趙江月1，閔曉潔1，羅文婷2，李晶1，吳欣蔚1，劉佳1，閻啟昌1，張勁松1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110005；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，沈陽 110004）

目的探討microRNA let-7a對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其在白內(nèi)障中的作用。方法利用Real time q-PCR方法，檢測年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜和正常人眼晶狀體前囊膜、人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型和正常人晶狀體上皮細(xì)胞系let-7a的表達(dá)情況；利用Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染let-7a mimic和let-7a inhibitor，分別上調(diào)和下調(diào)人晶狀體上皮細(xì)胞中l(wèi)et-7a的表達(dá)，并利用Real time q-PCR方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組let-7a的表達(dá)顯著低于正常對照組；人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型組let-7a的表達(dá)顯著低于正常對照組；let-7a mimic轉(zhuǎn)染組let-7a的表達(dá)顯著高于對照組，let-7a inhibitor轉(zhuǎn)染組let-7a的表達(dá)顯著低于對照組；let-7a mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組，let-7a inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論microRNA let-7a能夠調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，從而在白內(nèi)障發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，microRNA let-7a可能成為白內(nèi)障非手術(shù)治療的新靶點(diǎn)。

microRNA；let-7a；細(xì)胞凋亡；白內(nèi)障

隨著人口老齡化問題日趨嚴(yán)重，作為世界范圍內(nèi)首位致盲眼病，白內(nèi)障的發(fā)病率迅速上升，不僅嚴(yán)重?fù)p害老年人的視力，同時嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。盡管目前針對白內(nèi)障最有效的治療方法仍然是手術(shù)，但是存在患者對手術(shù)的恐懼心理、術(shù)后調(diào)節(jié)能力重建與后發(fā)性白內(nèi)障等一系列問題，手術(shù)治療的巨大醫(yī)療支出也給我國衛(wèi)生資源和社會經(jīng)濟(jì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。因此，探索白內(nèi)障非手術(shù)治療的新途徑勢在必行。近年來，微小RNA（micro-RNA，miRNA，miR）的發(fā)現(xiàn)為白內(nèi)障非手術(shù)治療研究帶來了新希望。

microRNA是一類長約21～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA［1］，通過與mRNA的3’非翻譯區(qū)序列完全或不完全互補(bǔ)配對，引起靶mRNA的降解或翻譯的抑制［2］，在轉(zhuǎn)錄后水平影響發(fā)育、增殖、分化、凋亡等過程中組織特異性基因的表達(dá)［3，4］，從而調(diào)控著人類整個基因組中大約1/3基因的表達(dá)［5］。有文獻(xiàn)報道，microRNA在白內(nèi)障發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中，對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控對白內(nèi)障發(fā)病過程有重要影響［6］，let-7家族與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡顯著相關(guān)［7］。

因此，本研究以let-7a為研究對象，利用年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜標(biāo)本及人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA01/04），通過轉(zhuǎn)染、紫外線照射、流式細(xì)胞技術(shù)等方法，測定let-7a對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響并探討其在白內(nèi)障發(fā)病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2014年5月至6月在我院眼科診斷為年齡相關(guān)性白內(nèi)障（排除其他眼部疾?。┗颊叩木铙w前囊膜標(biāo)本30例（實(shí)驗(yàn)組）。收集我院眼科眼庫提供的新鮮正常人眼晶狀體前囊膜標(biāo)本30例（對照組）。組織標(biāo)本收集獲得倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA01/04）由美國Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠贈。利用DMEM培養(yǎng)基（含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)SRA01/04細(xì)胞。

let-7a mimic、let-7a inhibitor及其陰性對照由Ribobio公司合成。將SRA01/04細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國）將50 nmol/L let-7a mimic與let-7a mimic control、100 nmol/L let-7a inhibitor與let-7a inhibitor control分別轉(zhuǎn)染至SRA01/04細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 紫外線照射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

紫外燈（XX-15B，Spectroline，Westbury，美國）光譜范圍280～320 nm，峰值為312 nm，取對數(shù)生長期SRA01/04細(xì)胞置于紫外光源下照射，照射強(qiáng)度為360 μW/cm2，照射時間為25 min，建立人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型［6］。照射前將培養(yǎng)液吸凈，PBS沖洗2次。照射時加入0.5 mL PBS，打開培養(yǎng)皿蓋。照射后置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.4 Real time q-PCR檢測let-7a的表達(dá)

利用Trizol?Reagent（Invitrogen公司，美國）提取總RNA，PrimerScriptTMRT Enzyme Mix（TaKaRa公司，日本）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司，日本）檢測let-7a的表達(dá)量，RNU6B為內(nèi)參對照。let-7a的RT引物、特異性上游引物和通用下游引物由Ribobio公司合成。利用ABI 7500（Applied Biosystems，美國），反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。經(jīng)過3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)，利用公式RQ=2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

利用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（KenGEN公司，中國），用胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，收集1×105～5× 105個細(xì)胞，加入195 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，室溫、避光、孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入190 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入10 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 let-7a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中的表達(dá)

利用Real time q-PCR方法，檢測30例年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜和30例正常人眼晶狀體前囊膜中l(wèi)et-7a的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組患者晶狀體前囊膜let-7a的表達(dá)顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1A。

2.2 let-7a在人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型中的表達(dá)

利用Real time q-PCR方法，檢測人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型和正常人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA01/ 04）中l(wèi)et-7a的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型組let-7a的表達(dá)顯著低于對照組，差 異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1B。

圖1 let-7a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織和人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型中的表達(dá)Fig.1 The expression of let-7a in both the age-related cataract lens tissues and the human lens epithelial cell apoptosis model

2.3 轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

向SRA01/04細(xì)胞中轉(zhuǎn)染let-7a mimic，mimic negative control，inhibitor，inhibitor negative control，為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，利用Real time q-PCR方法，檢測各組let-7a的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：let-7a mimic轉(zhuǎn)染組let-7a的表達(dá)顯著高于對照組（圖2A），let-7a inhibitor轉(zhuǎn)染組let-7a的表達(dá)顯著低于對照組（圖2B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明后續(xù)實(shí)驗(yàn)可按此條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.4 let-7a抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡

圖2 let-7a mimic、inhibitor轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證Fig.2 Verification of the transfection efficiency of let-7a mimic and inhibitor

向人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型中分別轉(zhuǎn)染let-7a mimic和inhibitor調(diào)節(jié)let-7a的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后48 h，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果顯示：let-7a mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組（圖3A），let-7a inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組（圖3B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。提示let-7a可能抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。

3 討論

自1993年首次發(fā)現(xiàn)microRNA以來［8］，迄今為止發(fā)現(xiàn)的成熟microRNA約一千余種［9］。microRNA通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)序列完全或不完全互補(bǔ)配對，引起靶mRNA的降解或翻譯的抑制，從而對基因表達(dá)、細(xì)胞分化、生長發(fā)育等進(jìn)行精細(xì)調(diào)控［2］。在腫瘤等疾病領(lǐng)域的研究中，已證實(shí)microRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［10，11］。microRNA應(yīng)用于慢性丙型肝炎、肝癌、血脂異常等疾病治療方面的研究也取得了突破性進(jìn)展［12～14］。

圖3 let-7a對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控Fig.3 The regulation effect of let-7a on apoptosis in human lens epithelial cells

在眼科領(lǐng)域的研究中發(fā)現(xiàn)，一些特異性的microRNA在眼部組織包括晶狀體、角膜、視網(wǎng)膜中有特定性的表達(dá)，并具有一定特點(diǎn)［15～19］。例如，Karali等［15］發(fā)現(xiàn)在晶狀體上皮細(xì)胞和赤道部表達(dá)較強(qiáng)的是miR-130、miR-124、miR-149、miR-185等，Ryan等［16］在成年小鼠晶狀體中報道了17種microRNAs，其中miR-184位于上皮細(xì)胞，在生發(fā)區(qū)表達(dá)較強(qiáng)，miR-204則均一地表達(dá)于所有上皮細(xì)胞。近年的研究表明，microRNA在白內(nèi)障的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［6，7，20］。例如，miR-125b可能通過直接抑制其靶基因p53的表達(dá)調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡［6］，miR-184的seed region突變可以導(dǎo)致前極性白內(nèi)障［20］，miR-31、miR-99a和b可能參與白內(nèi)障發(fā)病，let-7b與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡顯著相關(guān)［7］。

let-7a是let-7家族的一員，let-7家族是最先被鑒定的microRNA之一［21］。通過TargetScan、Diana-micro T、miRanda等生物信息學(xué)軟件預(yù)測，let-7a可能與凋亡最主要的通路——線粒體通路中的caspase-3、8、9等基因存在潛在結(jié)合的位點(diǎn)，推測let-7a可能通過調(diào)控其預(yù)測靶基因caspase-3、8、9等的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞凋亡。在對肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，let-7a能夠抑制細(xì)胞增殖、生長和轉(zhuǎn)移，因此可能成為肝癌治療的潛在有用分子［22］。let-7a還可能通過抑制cmyc基因的表達(dá)抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖［23］。在對黑素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，let-7a可促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞凋亡，同時下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)［24］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，let-7a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織以及人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型中均呈低表達(dá)。在細(xì)胞凋亡模型中調(diào)節(jié)let-7a的表達(dá)，進(jìn)一步研究細(xì)胞生物學(xué)功能的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)let-7a的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率顯著降低，下調(diào)let-7a的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率顯著升高。提示let-7a能夠抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，在白內(nèi)障的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可能成為白內(nèi)障非手術(shù)治療的新靶點(diǎn)。在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步探索let-7a通過調(diào)控哪些靶基因的表達(dá)調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，從而影響白內(nèi)障發(fā)病過程的具體分子機(jī)制。

綜上所述，let-7a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中低表達(dá)，let-7a能夠抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病過程中扮演重要的角色，let-7a可能成為白內(nèi)障非手術(shù)治療的新靶點(diǎn)。

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（編輯王又冬）

Research ofmicroRNA let-7a Inhibiting Human Lens EpithelialCellApoptosisin Cataract

QINYu1，ZHAOJiang-yue1，MINXiao-jie1，LUOWen-ting2，LIJing1，WUXin-wei1，LIUJia1，YANQi-chang1，ZHANGJinsong1
（1.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Eye Hospital of China Medical University，Key Lens Research Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110005，China；2.Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To study the regulation of apoptosis of human lens epithelial cells by microRNA let-7a and the effect of microRNA let-7a in cataract.MethodsThe real time q-PCR was used to measure the expression of let-7a in anterior lens capsules of patients with age-related cataract and in normal anterior lens capsules，as well as in human lens epithelial cell apoptosis model and in lens epithelial cell lines.Let-7a mimic and let-7a inhibitor were respectively transfected into SRA01/04 cells using Lipofectamine 2000 to up-regulate and down-regulate the expression of let-7a，and then the real time q-PCR was used to assess transfection efficiency.Flow cytometry was used to detect cell apoptosis rate.ResultsCompared with controls，the expression of let-7a was significantly lower in both the anterior lens capsules of patients with age-related cataract and the human lens epithelial cell apoptosis model.The expression of let-7a was increased in lens epithelial cells transfected with let-7a mimic，whereas it was decreased in cells transfected with let-7a inhibitor，compared with controls.The apoptosis rate was reduced for cells transfected with let-7a mimic，whereasitwas increased forthose transfected with let-7a inhibitor，compared with controls.Allresults were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionmicroRNA let-7a regulates human lens epithelial cell apoptosis and thus plays a critical role in the pathogenesis of cataract，which has the potentialto be a nonoperative therapeutic targetforcataract.

microRNA；let-7a；cell apoptosis；cataract

R776.1

A

0258-4646（2015）04-0302-05

國家自然科學(xué)基金（81270988）；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究一般項目（L2014305）；中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院青年創(chuàng)新發(fā)展基金項目（YB1217）

秦宇（1982-），女，講師，博士.

張勁松，E-mail：zhangjs0331@126.com

2014-12-23

網(wǎng)絡(luò)出版時間：