劉燕清， 強(qiáng)新濤， 趙春芳， 于 新， 姚 姝， 周麗慧， 陳 濤， 趙慶勇，朱 鎮(zhèn)， 張亞?wèn)|， 王才林

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國(guó)家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014)

淀粉是稻米胚乳中最主要的成分，占精米的90%，由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其中直連淀粉含量一直以來(lái)被認(rèn)為是衡量稻米食味品質(zhì)的最重要指標(biāo)［1-3］。直鏈淀粉是由蠟質(zhì)基因(Wx)編碼的顆粒結(jié)合淀粉合成酶(GBSS)催化而成的。支鏈淀粉由可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)以及淀粉去分支酶(DBE)等協(xié)同合成。在淀粉合成途徑中已報(bào)道了20多個(gè)相關(guān)基因參與編碼這些酶類，包括編碼ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大小亞基的AGPlar、AGPis、AGPsma基因及由不同剪接方式產(chǎn)生的多個(gè)基因，編碼淀粉合成酶的基因 Wx、GBSSII、SSI、SSIIa、SSIIb、SSIIc、SSIIIa、SSIIIb、SSIVa、SSIVb，編碼淀粉去分支酶的基因SBE1、SBE3、SBE4以及編碼去分支酶的ISA、PUL基因等［4-6］。近年來(lái)有學(xué)者認(rèn)為淀粉磷酸化酶和歧化酶也參與了淀粉合成，其編碼基因有PHO1、PHO2和DPE等［7］。面對(duì)如此眾多的參與淀粉合成的調(diào)控基因，要研究它們對(duì)稻米食味品質(zhì)的遺傳效應(yīng)，應(yīng)該首先明確它們?cè)诨蚪M水平上的基因型差異。

淀粉合成相關(guān)基因在水稻種質(zhì)資源中存在著豐富的自然變異這些等位變異決定了稻米品質(zhì)性狀的多樣性表現(xiàn)，在大量資源中挖掘淀粉合成相關(guān)基因的優(yōu)異等位變異是品質(zhì)性狀育種改良的重要研究?jī)?nèi)容［8］。目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)對(duì)淀粉合成相關(guān)基因進(jìn)行了序列分析，并設(shè)計(jì)了有效的基因型檢測(cè)分子標(biāo)記。謝會(huì)蘭［9］對(duì)13個(gè)品質(zhì)性狀上有差異的水稻品種中的18個(gè)淀粉合成相關(guān)基因進(jìn)行了測(cè)序，在基因序列上的InDel及SNP特異位點(diǎn)處有選擇地進(jìn)行標(biāo)記設(shè)計(jì)，研究了這些標(biāo)記在復(fù)等位基因研究方面的應(yīng)用潛力。李剛［10］基于水稻秈粳亞種數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，開發(fā)了淀粉合成相關(guān)基因的15個(gè)分子標(biāo)記，根據(jù)各基因標(biāo)記所劃分的基因型來(lái)分析非糯材料淀粉理化特征值的差異。田志喜等［11］通過(guò)分析16個(gè)典型水稻品種的淀粉合成相關(guān)基因的全基因序列，明確了各基因在不同種質(zhì)中的等位變異，設(shè)計(jì)了51個(gè)可以區(qū)分不同等位基因變異的分子標(biāo)記。

本研究盡可能多地收集了當(dāng)前文獻(xiàn)資料中的淀粉合成相關(guān)基因的分子標(biāo)記，在不同水稻品種中進(jìn)行了多態(tài)性篩選，并利用篩選到的差異等位基因標(biāo)記，在粳稻育種后代品系中進(jìn)行基因型鑒定，為分析淀粉合成相關(guān)基因的遺傳效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

包括3組水稻品種(系)，第一組為17份不同水稻品種，包括6個(gè)秈稻品種、8個(gè)粳稻品種和3個(gè)糯稻品種;第二組為28份粳稻親本，主要為全國(guó)各省的主栽品種;第三組為來(lái)源于關(guān)東194/武粳13組合后代的88份穩(wěn)定品系。

供試材料于2013年5月～10月種植在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)田。5月10日播種，6月10日移栽，常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 移栽后30 d取幼嫩葉片，采用 CTAB 法［12］提取 DNA。

1.2.2 淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì) 利用文獻(xiàn)報(bào)道的淀粉合成途徑中的調(diào)控基因及所用到的分子標(biāo)記信息［13-15］，由上海英俊生物科技有限公司合成分子標(biāo)記檢測(cè)引物，共合成了83對(duì)引物，包括STS和CAPS標(biāo)記。

1.2.3 DNA片段擴(kuò)增與酶切 PCR反應(yīng)在Eppendorf-5330 PCR 儀上擴(kuò)增，總體積 10.00 μl，其中dd H2O 6.55 μl，10 × Buffer 1.00 μl，dNTP 0.20 μl，Taq DNA 聚合酶 0.50 μl，上、下游引物各 1.00 μl，模板DNA 1.00 μl。PCR擴(kuò)增采用94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)。酶切體系:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10.00 μl，內(nèi)切酶 1.00 μl，10 × Buffer 2.00 μl，0.1%BSA 2.00 μl，dd H2O 5.00 μl。酶切時(shí)間為 1 h。產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠或者9.0%的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)。試驗(yàn)中所用內(nèi)切酶均購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2.4 聚類分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)擴(kuò)增帶的有無(wú)按1、0統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)矩陣。在相同遷移位置上，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，缺失記為“9”。每2份材料間的遺傳差異按Nei等［16］的方法計(jì)算遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離。根據(jù)所得遺傳相似系數(shù)，利用 NTSYS-pc Version 2.0 軟件［17］，用其中的 UPGMA方法進(jìn)行遺傳相似性聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記在秈粳亞種間的多態(tài)性

利用文獻(xiàn)報(bào)道的淀粉合成相關(guān)基因的83個(gè)分子標(biāo)記［13-15］，對(duì)6個(gè)秈稻品種、8個(gè)粳稻品種和3個(gè)糯稻品種進(jìn)行等位基因多態(tài)性檢測(cè)。83個(gè)標(biāo)記中60個(gè)能夠進(jìn)行很好的PCR擴(kuò)增，其中48個(gè)具有多態(tài)性，多態(tài)率為80%。利用48個(gè)多態(tài)性標(biāo)記的分子數(shù)據(jù)，計(jì)算17個(gè)水稻品種的遺傳相似性系數(shù)，其范圍在0.88～1.00。以遺傳相似性系數(shù)0.97為閾值，進(jìn)行UPGMA聚類分析，得到17個(gè)品種的淀粉合成相關(guān)基因分子數(shù)據(jù)的聚類圖(圖1)。由圖1看出，供試材料被分成3大類:第I類為粳稻分支，包括所有粳稻品種和2個(gè)糯稻品種，其中武粳13的遺傳背景與其他粳稻或糯稻有明顯差異，其他粳稻或糯稻間的基因序列保守性很高;第II類包括2個(gè)秈稻品種(9311和明恢63)和1個(gè)糯稻品種(蘇御糯)，與第I類同處于1個(gè)主分支上，說(shuō)明該類水稻品種的淀粉合成相關(guān)基因的序列更接近于粳稻;第III類包括4個(gè)秈稻品種(珍汕97B、龍?zhí)仄誃、桂朝2號(hào)和扎西瑪)，珍汕97B和龍?zhí)馗的基因序列一致，與其余兩秈稻品種間均存在明顯差異。聚類圖可以反映出，淀粉合成相關(guān)基因在粳稻中具有較高的保守性，在秈稻中變異較大，秈稻品9311和明恢63具有更偏向于粳稻背景的基因型。

圖1 淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記在17個(gè)水稻品種中的聚類分析Fig.1 Clustering analysis of 17 rice varieties

2.2 淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記在粳稻品種間的多態(tài)性

粳稻品種間的淀粉合成基因相對(duì)保守，序列變異性較低，只能篩選到與武粳13有差異的2個(gè)基因型，因此，為了獲得更多有等位基因差異的粳稻品種，我們擴(kuò)大了粳稻品種的數(shù)目，選擇了28個(gè)粳稻育種中廣泛使用的親本材料進(jìn)行進(jìn)一步篩選。利用48對(duì)在秈、粳、糯間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，篩選到6個(gè)淀粉合成相關(guān)基因(SSIIa、SSIIIa、SSIIIb、SBE3、ISA、PUL)上的分子標(biāo)記具有多態(tài)性，其中SSIIa和SSIIIb存在3種等位基因型，其余4個(gè)基因均存在2種等位基因型，圖2為6個(gè)基因上的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果。

2.3 可溶性淀粉合成酶基因SSIIa、SSIIIa分子標(biāo)記在粳稻育種品系中的檢測(cè)

在粳稻親本的篩選結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉合酶基因SSIIa和SSIIIa的分子標(biāo)記在關(guān)東194和武粳13間均表現(xiàn)出多態(tài)性。因此，利用SSIIa和SSIIIa的分子標(biāo)記對(duì)關(guān)東194和武粳13雜交組合的88份后代衍生系進(jìn)行了基因型檢測(cè)。在88份品系中分別檢測(cè)到SSIIa關(guān)194SSIIa關(guān)194和 SSIIa武13SSIIa武13基因型的品系分別為30個(gè)和58個(gè)，SSIIIa關(guān)194SSIIIa關(guān)194和SSIIIa武13SSIIIa武13基因型的品系分別為69和19個(gè)，檢測(cè)到2個(gè)基因的4種 基 因 型 SSIIa關(guān)194SSIIa關(guān)194/SSIIIa關(guān)194SSIIIa關(guān)194、SSIIa關(guān)194SSIIa關(guān)194/SSIIIa武13SSIIIa武13、SSIIa武13SSIIa武13/SSIIIa關(guān)194SSIIIa關(guān)194和SSIIa武13SSIIa武13/SSIIIa武13SSIIIa武13的品系分別為12個(gè)、18個(gè)、57個(gè)和1個(gè)(表1)。

圖2 淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記在28個(gè)粳稻親本中的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The classification of 28 japonica rice based on the polymorphisms by the markers for six genes

表1 88份關(guān)東194/武粳13雜交育種品系的基因型檢測(cè)Table 1 Genotypic detection of 88 breeding lines derived from Guandong 194/Wujing 13

3 討論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記在水稻品種鑒定和遺傳育種中發(fā)揮著極其重要的作用。如利用SSR標(biāo)記建立水稻品種的DNA指紋圖譜［18］，利用稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的基因內(nèi)標(biāo)記檢測(cè)抗病品種［19］，利用抗條紋葉枯病基因(Stv-bi)的SCAR標(biāo)記定向改良水稻品種的條紋葉枯病抗性［20-21］。低直鏈淀粉含量基因(Wx-mq)的CAPs和四引物標(biāo)記在優(yōu)質(zhì)育種中也有廣泛應(yīng)用，利用分子標(biāo)記已經(jīng)培育出一系列含Wx-mq基因的優(yōu)良食味粳稻品種如Milky Queen、關(guān)東194、南粳46、南粳9108等［22-25］。為了獲得更多具有利用價(jià)值的優(yōu)良食味基因，本研究利用分子標(biāo)記檢測(cè)的方法，對(duì)淀粉合成途徑中所有調(diào)控基因的基因型對(duì)17份秈、粳品種和28份粳稻親本進(jìn)行了系統(tǒng)篩選。17份秈、粳品種的檢測(cè)結(jié)果表明，淀粉合成相關(guān)基因在秈粳亞種間表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，在秈稻亞種內(nèi)的變異較大，而在粳稻亞種內(nèi)則相對(duì)保守，序列相似性較高。另外我們發(fā)現(xiàn)秈稻品種9311和明恢63中的淀粉合成相關(guān)基因的基因型更接近于粳稻，可能由于它們基因組上包含了粳稻背景如9311基因組被認(rèn)為含30%的粳稻序列的緣故。該研究結(jié)果與前人利用SSR標(biāo)記對(duì)不同水稻品種全基因組遺傳多樣性的鑒定結(jié)果［26-29］是相似的，從而說(shuō)明了在水稻亞種間，淀粉合成相關(guān)基因的序列變異特征與其整個(gè)基因組序列的變異是一致的。

目前較多的研究結(jié)果表明，中國(guó)粳稻品種間特別是江蘇省育成的粳稻品種間遺傳多樣性單一，程寶山等［30］研究發(fā)現(xiàn)江蘇粳稻主栽品種遺傳相似系數(shù)為0.75～0.98，變異幅度很小。趙慶勇等［31］研究結(jié)果表明，江蘇省育成的水稻品種遺傳多樣性不夠豐富，多數(shù)品種間親緣關(guān)系較近。鑒于粳稻品種間遺傳背景單一的情況，我們?cè)趯?duì)28份粳稻親本的淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果中，仍特異性地篩選到6個(gè)基因的差異標(biāo)記，找到了一些含差異等位基因的親本。如武粳13與關(guān)東194、寧0145等品種在可溶性淀粉合成酶基因SSIIa和SSIIIa上有等位基因差異，金粳18與關(guān)東194等品種在淀粉分支酶基因ISA和去分支酶基因PUL上有基因差異。我們對(duì)SSIIa和SSIIIa的分子標(biāo)記在武粳13與關(guān)東194配置組合的后代品系中進(jìn)行了驗(yàn)證，獲得了一些含單基因和雙基因組合的材料，但是很遺憾我們只獲得1份含SSIIa武13SSIIIa武13雙基因型的材料，可能后續(xù)還需要增加檢測(cè)的樣本數(shù)量。另一方面，在后期研究中我們將測(cè)定這些品系的食味品質(zhì)性狀，如直鏈淀粉含量、糊化溫度、膠稠度等淀粉相關(guān)理化參數(shù)，根據(jù)基因型與表型數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，明確SSIIa和SSIIIa不同基因型間及雙基因組合間的遺傳效應(yīng)大小，從而為粳稻品種食味品質(zhì)的改良提供有用的基因型。

本研究通過(guò)對(duì)淀粉合成途徑上調(diào)控基因分子標(biāo)記在不同品種間多態(tài)性的系統(tǒng)篩選，明確了含差異等位基因的水稻材料，證實(shí)了淀粉合成相關(guān)基因分子標(biāo)記對(duì)育種材料進(jìn)行基因型篩選的可行性，該研究結(jié)果為后續(xù)淀粉合成相關(guān)基因?qū)κ澄镀焚|(zhì)的遺傳效應(yīng)分析奠定了良好基礎(chǔ)，為水稻食味品質(zhì)改良中的親本選擇、雜交后代的基因型篩選以及食味品質(zhì)的定向改良提供了重要信息。

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