吳莎+王雪+吳亞男+劉啟安+吳建雄+畢宇安+王振中+蕭偉

[摘要] 該文建立超高效液相色譜法（UPLC）同時測定熱毒寧注射液中新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸B，異綠原酸A，異綠原酸C，山梔苷，京尼平苷酸，京尼平龍膽雙糖苷，梔子苷和斷氧化馬錢子苷共11種有效成分含量，并建立熱毒寧注射液UPLC指紋圖譜，用于熱毒寧注射液質(zhì)量控制。該方法采用Agilent ZORBAX SB-C₁₈色譜柱（3.0 mm×100 mm， 1.8 μm），預(yù)柱為Agilent UPLC Guard ZORBAX SB-C₁₈（3.0 mm×5 mm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫;流速0.4 mL·min^-1，進(jìn)樣量2 μL，柱溫30 ℃，檢測波長324，238 nm用于含量測定，225 nm用于指紋圖譜。結(jié)果顯示新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸B，異綠原酸A，異綠原酸C，山梔苷，京尼平苷酸，京尼平龍膽雙糖苷，梔子苷和斷氧化馬錢子苷11個被測組分達(dá)到基線分離;在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999;平均回收率分別為103.5%，100.2%，103.3%，102.8%，101.3%，102.8%，97.36%，99.62%，98.16%，102.8%，99.27%。對45批熱毒寧注射液進(jìn)行UPLC指紋圖譜研究，以其中的30批生成對照指紋圖譜，計算余下15批熱毒寧注射液與對照指紋圖譜的相似度，相似度值均大于0.99。該方法快速準(zhǔn)確靈敏，可為熱毒寧注射液多成分含量測定和指紋圖譜質(zhì)量控制提供參考。

[關(guān)鍵詞] 超高效液相色譜法; 熱毒寧注射液; 多成分含量測定; 指紋圖譜; 質(zhì)量控制

[收稿日期] 2014-09-08

[基金項目] 國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2013ZX09402203）

[通信作者] 蕭偉，博士，研究員級高級工程師，研究方向為中藥新藥的研究與開發(fā)，Tel： （0518）85522009，E-mail： wzhzh-nj@163.net

[作者簡介] 吳莎，博士研究生，Tel：13675292285，E-mail：wusha729@163.com

熱毒寧注射液由金銀花、青蒿、梔子組成，具有清熱、疏風(fēng)、解毒功效，臨床上用于治療上呼吸道感染[1]。熱毒寧注射液成分研究表明，其主要含有有機(jī)酸類和環(huán)烯醚萜類化合物[2-3]。前期研究建立了熱毒寧注射液HPLC指紋圖譜[4]和一測多評法測定熱毒寧注射液中的9種成分[5]，上述方法運(yùn)行時間較長， 針對處方中梔子藥材只選擇梔子苷作為控制指標(biāo)較為局限。梔子中富含環(huán)烯醚萜類化合物[6-7]，有研究報道同時測定梔子藥材中多種環(huán)烯醚萜苷類成分含量[8-10]，及有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜苷和色素3類成分含量[11]。超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)可以大大縮短分析時間，提高分析的靈敏度和分辨率，在中藥注射液質(zhì)量控制方面有較為廣泛地應(yīng)用[12-15]。因此，本研究建立了一種超高效液相色譜方法，同時測定熱毒寧注射液中11種成分含量（包括6種有機(jī)酸類化合物和5種環(huán)烯醚萜類化合物），并建立熱毒寧注射液指紋圖譜。該方法簡單快捷靈敏，可為熱毒寧注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀（配有DAD檢測器、四元梯度泵、在線脫氣裝置、自動進(jìn)樣器，美國安捷倫公司）;SB25-12DTD-500數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）;METTLER TOLEDO XP6電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;H1650-W臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）;Millipore Milli-Q純水機(jī)（美國Millipore公司）。

對照品綠原酸（批號110753-201314）和梔子苷（批號110749-201115）均購自中國食品藥品檢定研究院;對照品新綠原酸（批號MUST-13013001），隱綠原酸（批號MUST-13013002），京尼平苷酸（批號MUST-12121502），異綠原酸B（批號MUST-14022612），異綠原酸A（批號MUST-13081402）和異綠原酸C（批號MUST-13081401）均購自成都曼思特生物科技有限公司;對照品山梔苷（批號BBP01688）購自云南西力生物技術(shù)有限公司;對照品京尼平龍膽雙糖苷（批號121120）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;對照品斷氧化馬錢子苷由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供。綠原酸對照品純度為96.6%，其他對照品純度均大于98%。乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

45批熱毒寧注射液（批號分別為Z140201， Z140203， Z140204， Z140205， Z140206， Z140207， Z140208， Z140209， Z140210， Z140211， Z140212， Z140213， Z140214， Z140215， Z140216， Z140217， Z140218， Z140219， Z140220， Z140221， Z140222， Z140223， Z140224， Z140225， Z140226， Z140227， Z140228， Z140229， Z140230， Z140231， Z140232， Z140233， Z140234， Z140301， Z140303， Z140304， Z140305， Z140306， Z140307， Z140308， Z140309， Z140310， Z140311， Z140312， Z140313）均由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件endprint

Agilent ZORBAX SB-C₁₈色譜柱（3.0 mm×100 mm， 1.8 μm）;預(yù)柱Agilent UPLC Guard ZORBAX SB-C₁₈（3.0 mm×5 mm）;流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B）;流速0.4 mL·min^-1;梯度洗脫（0～10 min，5%～10%A;10～15 min，10%～15%A;15～30 min，15%～30%A）;進(jìn)樣量2 μL;柱溫30 ℃;檢測波長324，238 nm用于含量測定，225 nm用于指紋圖譜。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸A，異綠原酸B，異綠原酸C，山梔苷，京尼平苷酸，京尼平龍膽雙糖苷，梔子苷和斷氧化馬錢子苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為122.3，289.5，123.6，16.1，28.5，23.2，16.7，24.7，236.6，407.7，57.5 mg·L^-1的混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取1 mL熱毒寧注射液置100 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心，上清液過0.22 μm微孔濾膜濾過，既得。

2.4 線性關(guān)系、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）的考察

分別精密量取混合對照品儲備液1，2，4，6，8，10 mL置20 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，分別取上述溶液2 μL注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件，測定峰面積。以峰面積積分值y對質(zhì)量濃度x （mg·L^-1）進(jìn)行回歸分析，得到各對照品的回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表1。將混合對照品溶液用50%甲醇進(jìn)行逐級稀釋后測定，得到各成分的LOD （S/N=3）和LOQ （S/N=10），結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗

精密量取對照品儲備液4 mL置20 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸B，異綠原酸A，異綠原酸C，山梔苷，京尼平苷酸，京尼平龍膽雙糖苷，梔子苷和斷氧化馬錢子苷峰面積的RSD（n=6）分別為0.87%，0.50%，1.4%，1.2%，1.4%，1.6%，0.73%，1.5%，0.41%，0.14%，0.31%，說明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批次（批號Z140203）熱毒寧注射液，按2.3項下方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸B，異綠原酸A，異綠原酸C，山梔苷，京尼平苷酸，京尼平龍膽雙糖苷，梔子苷和斷氧化馬錢子苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=6）分別為2.28，6.61，2.54，0.410，0.230，0.390，0.270，0.510，6.25，9.85，1.10 g·L^-1，RSD分別為1.2%，1.1%，1.3%，1.5%，1.6%，1.6%，1.8%，1.7%，0.72%，0.70%，1.8%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批次（批號Z140203）熱毒寧注射液的供試品溶液，室溫下放置，分別在不同時間點(diǎn)（0，2，4，8，16，24 h）進(jìn)樣，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，結(jié)果新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸B，異綠原酸A，異綠原酸C，山梔苷，京尼平苷酸，京尼平龍膽雙糖苷，梔子苷和斷氧化馬錢子苷峰面積的RSD分別為0.69%，0.86%，1.3%，1.3%，0.54%，0.93%，1.9%，1.7%，1.3%，0.69%，1.8%，說明樣品溶液中各成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批（批號Z140203）熱毒寧注射液0.5 mL，置100 mL量瓶中，精密加入混合對照品儲備液12.5 mL，加入50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過。同法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣2 μL，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 耐用性試驗

2.9.1 柱溫對系統(tǒng)的影響 將柱溫分別調(diào)為25，30，35 ℃，取同一份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸B，異綠原酸A，異綠原酸C，山梔苷，京尼平苷酸，京尼平龍膽雙糖苷，梔子苷和斷氧化馬錢子苷含量的RSD（n=3）分別為1.2%，0.84%，1.1%，1.2%，1.4%，1.3%，1.6%，1.6%，1.3%，0.92%，1.5%。本法柱溫在25～35 ℃變化時，耐用性良好。

2.9.2 流速對系統(tǒng)的影響 將流速分別調(diào)為0.35，0.4，0.45 mL·min^-1，取同一份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸B，異綠原酸A，異綠原酸C，山梔苷，京尼平苷酸，京尼平龍膽雙糖苷，梔子苷和斷氧化馬錢子苷含量的RSD（n=3）分別為1.4%，1.2%，1.2%，1.4%，1.6%，1.5%，1.8%，1.7%，1.2%，1.3%，1.4%。本法流速在0.35～0.45 mL·min^-1變化時，耐用性良好。

2.10 樣品測定

取Z140201，Z140211，Z140220，Z140229，Z140305和Z140313批熱毒寧注射液，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定各成分含量，結(jié)果見表3，UPLC色譜圖見圖1。endprint

2.11 UPLC指紋圖譜建立

2.11.1 精密度試驗 取同一批號（批號Z140203）的熱毒寧注射液，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD在0.050%～0.45%，相對峰面積的RSD在0.48%～2.2%，表明儀器精密度較好。

2.11.2 重復(fù)性試驗 取同一批號（批號Z140203）的熱毒寧注射液，按2.3項下方法重復(fù)制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD在0.080%～0.62%，相對峰面積的RSD在0.65%～2.4%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.11.3 穩(wěn)定性試驗 取重復(fù)性試驗項下供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別在0，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD在0.16%～0.68%，相對峰面積的RSD在0.51%～2.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11.4 指紋圖譜的建立 利用上述指紋圖譜方法，測定45批熱毒寧注射液指紋圖譜，疊加圖譜見圖2。選擇前30批熱毒寧注射液指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價2004A版》，標(biāo)定了14個共有峰，生成對照指紋圖譜，見圖3。對照指紋圖譜中有3個未知成分，11個已知成分，分別為山梔苷（2），京尼平苷酸（3），新綠原酸（4），綠原酸（5），京尼平龍膽雙糖苷（6），隱綠原酸（7），梔子苷（8），斷氧化馬錢子苷（11），異綠原酸B（12），異綠原酸A（13）和異綠原酸C（14）。對照指紋圖譜中以8號色譜峰作為參照峰，計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積。將余下15批熱毒寧注射液指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價2004B版》，用夾角余弦法計算它們與對照指紋圖譜的相似度，相似度值均大于0.99。

3 討論

3.1 流動相的選擇

流動相篩選過程中，考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸、甲醇-醋酸梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)以甲醇為流動相時，山梔苷和京尼平苷酸出峰時間相近，達(dá)不到基線分離;以水為流動相時，色譜峰拖尾嚴(yán)重;以醋酸為流動相時，基線漂移嚴(yán)重。故選擇乙腈-磷酸為流動相，色譜峰峰形較好，分離度較高。

3.2 梯度條件的選擇

乙腈-磷酸體系下不同梯度條件比較，由于有機(jī)酸類成分在324，238 nm下均有吸收峰，使得238 nm下隱綠原酸峰干擾京尼平龍膽雙糖苷峰，甚至兩者合并出峰。經(jīng)過層層優(yōu)選，確定適當(dāng)?shù)奶荻葪l件，使京尼平龍膽雙糖苷和隱綠原酸達(dá)到基線分離。

3.3 檢測波長的選擇

對照品溶液在200～800 nm全波長掃描，結(jié)果表明環(huán)烯醚萜類成分在238 nm處有最大吸收，有機(jī)酸類成分在324 nm處有最大吸收。值得注意的是，有機(jī)酸類成分在238 nm也有吸收，但是響應(yīng)值較324 nm處吸收低。因此選擇324 nm測定新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸B，異綠原酸A和異綠原酸C，選擇238 nm測定山梔苷、京尼平苷酸、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷和斷氧化馬錢子苷。經(jīng)過多個波長比較選擇，在225 nm下指紋圖譜中色譜峰最多，因此選擇225 nm作為指紋圖譜測定波長。

本文建立的UPLC同時測定熱毒寧注射液中11種成分含量，該方法準(zhǔn)確快速靈敏，較前期研究增加測定了山梔苷、京尼平苷酸和京尼平龍膽雙糖苷這3個環(huán)烯醚萜類成分。建立的熱毒寧注射液UPLC指紋圖譜，有14個共有峰，共有峰峰面積之和占總峰面積的95%以上。本實驗建立的方法可以同時測定熱毒寧注射液中11種成分的含量及熱毒寧注射液指紋圖譜，從定性和定量的角度全面反映熱毒寧注射液中的主要化學(xué)成分，提高了熱毒寧注射液質(zhì)量控制水平。

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Determination of eleven major components and fingerprint

chromatography for Reduning injection by UPLC

WU Sha， WANG Xue， WU Ya-nan， LIU Qi-an， WU Jian-xiong， BI Yu-an， WANG Zhen-zhong， XIAO Wei

（1.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China;

2.Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China;

3.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process， Lianyungang 222001， China）

[Abstract] A reliable method for simultaneous determinition of eleven representative components （neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， isochlorogenic acid B， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C， shanzhiside， geniposidic acid， genipin-1-β-D-gentiobioside， geniposide and secoxyloganin） in combination of chromatographic fingerpint analysis for Reduning injection was developed by ultra high-performance liquid chromatography （UPLC）. The method was performed on an Agilent ZORBAX SB-C₁₈ anlytical column （3.0 mm×100 mm， 1.8 μm） with a guard column of Agilent UPLC Guard ZORBAX SB-C₁₈ （3.0 mm×5 mm） at the column temperature of 30 ℃. The gradient mobile phase consisted of acetonitrile （A）-0.1% phosphoric acid （B） with a flow rate of 0.4 mL·min^-1. The injection volumn was 2 μL. The detection wavelengths were set at 324 nm and 238 nm for quantitative analysis and 225 nm for fingerpint chromatography. Neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， isochlorogenic acid B， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C， shanzhiside， geniposidic acid， genipin-1-β-D-gentiobioside， geniposide and secoxyloganin were baseline seperated with good linearity relationships （r>0.999） between concentration and peak areas over the linear ranges. The average recoverys of the investigated compounds were 103.5%，100.2%，103.3%，102.8%，101.3%，102.8%，97.36%，99.62%，98.16%，102.8%，99.27%， respectively. Reduning injection of forty-five batches was analyzed by UPLC fingerprint chromatography. Thirty batches were selected to generate the reference fringerprint chromatography with fourteen common peaks. The similarity values between the reference fringerprint chromatography and the remaining fifteen batches were higher than 0.99. The developed method was fast， accurate and sensitive. It could be used as a reference for the quality control of multiple components determination and fingerprint chromatography for Reduning injection in future.

[Key words] UPLC; Reduning injection; multiple components determination; fingerprint chromatography; quality control

doi：10.4268/cjcmm20142421

[責(zé)任編輯 馬超一]endprint