張晶瑩 宋昕恬 張琨 隋自潔 高峰

人參與林蛙油配伍的保健食品體外致突變試驗(yàn)研究

張晶瑩 宋昕恬 張琨 隋自潔 高峰

目的 體外觀察人參與林蛙油配伍的保健食品能否誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株的回復(fù)突變。方法 Ames試驗(yàn)用TA97、TA98、TA100、TA102菌株并分加與不加肝微粒體酶活化系統(tǒng)(+/-S9)試驗(yàn)。結(jié)果 人參與林蛙油配伍的保健食品對4個(gè)菌株各劑量組的回復(fù)菌落數(shù)都未超過自然回復(fù)菌落數(shù), Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。結(jié)論 在5000-8 μg/皿劑量下未見人參與林蛙油配伍的保健食品致突變性。

人參；林蛙油；配伍；保健食品；Ames試驗(yàn)；致突變性

人參作為著名的中草藥, 在我國已經(jīng)使用了幾千年之久, 據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“人參主補(bǔ)五臟, 安精神, 定魂魄, 止驚悸, 除邪氣, 明目開心益智, 久服輕身延年”［1］。 林蛙油又稱蛤蟆油、田雞油、哈什螞油, 為雌性林蛙干燥的輸卵管制品, 具有補(bǔ)腎益精、潤肺養(yǎng)陰之功效, 其主要分布東北長白山區(qū)。林蛙油中含有多種生理活性物質(zhì), 具有明顯的生理保健作用［2］。因此, 本文采用Ames 試驗(yàn)平皿摻入法對人參與林蛙油配伍的保健食品進(jìn)行了體外致突變效應(yīng)初步探討, 為其保健食品開發(fā)利用提出科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人參與林蛙油配伍的保健食品, 由本實(shí)驗(yàn)室自制；敵克松、疊氮鈉、二氨基芴、1, 8-二羥基蒽醌均購

自Sigma公司；D-生物素、L-鹽酸組氨酸購自Fluka公司；鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102和S9均購自上海啟發(fā)實(shí)驗(yàn)有限公司。

1.1.2 儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴箱, 均由上?；|試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)；立式壓力蒸汽滅菌儀(YXQ-LS-50G型), 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)；METTLER TOLEDO-AB204-N分析天平, 上海產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法 依據(jù)《保健食品安全性毒理學(xué)評價(jià)程序和檢驗(yàn)方法規(guī)范》中介紹的平板摻入法進(jìn)行試驗(yàn)［3］。試驗(yàn)設(shè)5000、1000、200、40、8 μg/皿5個(gè)劑量。取2.5 g受試物加二甲基亞砜至50 ml混均即為5000 μg/皿劑量, 其余各受試物劑量1/5倍比遞減稀釋；上述受試液經(jīng)滅菌(時(shí)間：20 min,溫度：121℃, 壓力：0.103 MPa)后使用；另設(shè)未處理對照、溶劑對照、陽性對照。在頂層瓊脂中加入0.1 ml試驗(yàn)菌株增菌液、0.1 ml受試物溶液, 代謝活化時(shí)加入0.5 ml S9混合液,混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上。37℃, 培養(yǎng)48 h, 計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。如果受試物的回變菌落數(shù)是自發(fā)回變菌落數(shù)2倍以上, 并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系者則定為陽性。每個(gè)劑量做3個(gè)平行。整套試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)做2次并分別統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 陽性對照 活化系統(tǒng)TA97、TA98、TA100采用二氨基芴10.0 μg/皿, TA102為1, 8-二羥基蒽醌50.0 μg/皿。非活化系統(tǒng)TA97、TA98、TA102為敵克松50.0 μg/皿, TA100為疊氮鈉1.5 μg/皿。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示, 將人參與林蛙油配伍的保健食品在鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株TA97、TA98、TA100、TA102進(jìn)行平板摻入試驗(yàn), 無論在加和不加S9混合液時(shí), 8～5000 μg/皿各劑量組均未引起試驗(yàn)菌株的回復(fù)突變菌落數(shù)顯著增加, 與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；溶劑對照組的菌落回變數(shù)與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；陽性誘變劑誘發(fā)回變菌落數(shù)均明顯增加, 與陰性對照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

Ames試驗(yàn)是國際上通用的遺傳毒理學(xué)鑒定致突變的必檢項(xiàng)目之一。采用鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株作為微生物, 檢測化學(xué)物的致突變性。人工誘變的鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株在其組氨酸操縱子中有一個(gè)突變, 突變菌株必需以來外源性組氨酸才能生長, 在無組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活, 誘變劑可使其基因發(fā)生回復(fù)突變, 使它在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上也能生長［4］。另外, Ames試驗(yàn)在安全性評價(jià)方面具有舉足輕重的作用, 應(yīng)在生物安全柜中操作及觀察結(jié)果, 注意嚴(yán)格無菌操作, 以保證本次試驗(yàn)結(jié)果的可靠性［5］。

本試驗(yàn)將人參與林蛙油配伍的保健食品與各標(biāo)準(zhǔn)菌液混合后在最低營養(yǎng)板上培養(yǎng), 依據(jù)出現(xiàn)的回變菌落數(shù)及致突變比值來判斷其是否存在誘變物質(zhì)。結(jié)果顯示, 在有無S9的作用下, 人參與林蛙油配伍的保健食品各劑量組均未發(fā)現(xiàn)測試菌株回變菌落數(shù)超過陰性對照組回變菌落數(shù)的2倍, 且無劑量-反應(yīng)關(guān)系, 而陽性對照組各測試菌株的回變菌落數(shù)均明顯增加, 并超過陰性對照組回變菌落數(shù)的2倍以上, 證實(shí)本實(shí)驗(yàn)條件下, 鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株對人參與林蛙油配伍的保健食品檢測結(jié)果為陰性, 試驗(yàn)結(jié)果表明, 人參與林蛙油配伍的保健食品在5000-8μg/皿的劑量內(nèi)無致突變性, 為其進(jìn)行功能學(xué)評價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) .北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 261.

［2］ Hwang J, Kleinhenz DJ, RUpnow HL, et al.The PPAR gamma ligand, rosiglitazone, reduces vascular oxidative stress and NADPH oxidaseexpression in diabetic mice.Vascul Pharmacol, 2007, 46(6): 456-462.

［3］ 中華人民共和國衛(wèi)生部, 國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.保健食品安全性毒理學(xué)評級程序和檢驗(yàn)方法規(guī)范(2003版) .北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2004:24-35.

［4］ Li J, Kong X, Li X, et al.Genotoxic evaluation of aspirin eugenol ester using the Ames test and the mouse bone marrow micronucleus assay.Food Chem Toxicol, 2013, 62(12):805-809.

［5］ Anjum R, Krakat N, Toufiq Reza M, et al.Assessment of mutagenic potential of pyrolysis biochars by Ames Salmonella/mammalianmicrosomal mutagenicity test.Ecotoxicol Environ Saf, 2014, 107(19):306-312.

2014-08-28］

吉林省醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：20130727075YY)

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