高瑞昌，陸文婷，劉向東，崔恒林，袁麗

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江，212031)

魚露(fish sauce)，又稱魚醬油，是閩菜、潮州菜和東南亞料理中常用的調(diào)味料之一。它是以小魚蝦為原料，利用魚體所含的蛋白酶和其他酶以及在多種微生物共同參與下，對原料魚中的蛋白質(zhì)、脂肪等成分進行發(fā)酵釀制而成［1］。傳統(tǒng)的天然發(fā)酵過程非常緩慢，這是限制其產(chǎn)量和規(guī)模的主要因素。某些嗜鹽古菌作為外源添加物可以加快魚露的發(fā)酵，其一，它與魚中的微生物群落在發(fā)酵過程中起協(xié)同作用［2］;二，它能產(chǎn)生胞外蛋白酶，在高鹽高滲的環(huán)境下催化蛋白質(zhì)的水解，加速魚露的發(fā)酵，而且不會有其他速釀方法產(chǎn)生不良風(fēng)味等問題［3］。本文利用前期篩選出的4種具有良好產(chǎn)蛋白酶活性的嗜鹽古菌進行魚露發(fā)酵，通過對魚露發(fā)酵過程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽、總胺、氨基酸態(tài)氮和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等指標進行評價，以期挑選出更加適宜發(fā)酵魚露的菌種，為魚露的快速發(fā)酵提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

實驗材料:TBN4-Halalkalicoccus tibetensis，TNN48-Halogranum rubrum，RO2-11-Halogranum rubrum，9738-Halomicrobiummukohataei，江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏菌種(課題組前期從臺南鹽田篩選，鑒定);龍頭魚，購自鎮(zhèn)江歐尚超市。

實驗設(shè)備:PHS-3C型pH計(LIDA)、LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;722N可見分光光度計，上海精科;HP6890/5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司;頂空固相微萃取器SPMC-57328U，美國Agilent公司;自動氨基酸分析儀，德國sykamS433D/S433。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚露的制作

利用購自歐尚超市新鮮的龍頭魚，去除內(nèi)臟，切碎，并加入20%的食鹽，混勻，分別加入109CFU數(shù)量級 TBN4，TNN48，9739，RO2-11 菌種，并以未加入任何菌種含有20%食鹽的魚肉作為對照組，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進行發(fā)酵。發(fā)酵4.5月后，測定各魚露的指標含量，并與新鮮原料魚相比較。

1.2.2 理化指標的測定

氨基酸態(tài)氮(AAN)含量:甲醛滴定法［4］;總酸的測定，參考文獻［5］;可溶性總氮(TSN):凱式定氮法［4］;組胺含量的測定，參考文獻［6］。

亞硝酸鹽含量:分光光度法［7］。稱取經(jīng)絞碎并混合均勻的樣品20 g于100 mL燒杯中，加硼砂飽和溶液40 mL，攪拌均勻后，以70℃以上的熱水100～150 mL將樣品全部洗入250 mL容量瓶中，放入沸水浴中加熱15 min，取出冷卻后，邊轉(zhuǎn)動容量瓶邊加入亞鐵氰化鉀溶液(106g/L)20 mL，搖勻后，再加入醋酸鋅溶液(220 g/L)20 mL，以沉淀蛋白質(zhì)。然后，加水至刻度，混勻，放置30 min后，棄去上層脂肪，清液用濾紙過濾，棄去初濾液5～10 mL，濾液備用。吸取上述濾液40 mL于50 mL容量瓶中，同時吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL NaNO2標準液(相當于 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg的NaNO2)分別置于50 mL容量瓶中，各加水至25 mL處。在樣品管及標準管中分別加入0.4%對氨基苯磺酸溶液(4 g/L)4 mL，混勻后靜置3～5 min，然后又在各管及標準管中分別加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液(2 g/L)2 mL，加水至刻度，搖勻，靜置15 min后，用1 cm的比色皿，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長538 nm處，測吸光度，繪制標準曲線并查出待測液的亞硝酸鹽含量。

亞硝酸鹽(以NaNO2計)含量計算:

式中:X1—試樣中NaNO2的含量，mg/kg;A1—測定用樣液中NaNO2的質(zhì)量，μg;m—試樣質(zhì)量，g;V1—測試用樣液體積，mL;V0—試樣處理液總體積，mL。

總胺值的測定［8］:在250 mL錐形瓶中，加入適量1～5 g試樣(視胺值大小而定，稱準至0.000 2 g)，然后加入50 mL無水乙醇，煮沸1 min，除去游離氨，冷卻至室溫，加入5滴0.2%溴酚藍指示劑，用0.5 mol/L鹽酸異丙醇溶液滴定至黃色為終點。總胺價(KOHmg/g)計算:

式中:C—HCl標準溶液濃度，mol/L;V—HCl標準溶液的用量，mL;M—試樣質(zhì)量，g;56.11—每摩爾KOH相當?shù)馁|(zhì)量，g。

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量的測定:微量擴散法［6］。稱取10 g樣品于錐形瓶中，加100 mL水，不時振搖，浸漬30 min后過濾，濾液置于冰箱中備用。將水溶性膠涂于擴散皿的邊緣，在皿中央內(nèi)室加入1 mL 2%硼酸吸收液及1滴0.2%甲基紅乙醇溶液和0.1%亞甲藍水溶液等體積混合指示液。在皿外室一側(cè)加入1.00 mL樣液，另一側(cè)加入1 mL飽和碳酸鉀溶液，注意勿使2滴接觸，立即蓋好;密封后將皿于桌面上輕輕轉(zhuǎn)動，使樣液與堿液混合。將擴散皿置于37℃溫箱內(nèi)放置2h，揭去蓋，用0.01 mol/L HCl標準溶液或硫酸標準溶液滴定，終點呈藍紫色。同時做試劑空白試驗。

式中:X—樣品中揮發(fā)性鹽基氮的含量，mg/100g;V1—測定用樣液消耗HCl或H2SO4標準溶液體積，mL;V2—試劑空白消耗HCl或H2SO4標準溶液體積，mL;N—HCl或H2SO4標準溶液的摩爾濃度，mol/L;m—樣品質(zhì)量，g;14—1 mol/L HCl或 H2SO4標準溶液1 mL相當?shù)馁|(zhì)量，mg。

1.2.3 游離氨基酸組成的測定

(1)魚露樣品脫鹽

由于在制作魚露時，加入20%鹽，魚露樣品內(nèi)鹽含量過高，在測游離氨基酸組成時需先進行脫鹽。

在一定量的魚露樣品中加入3%(重量)活性炭，于80℃下脫色30 min，趁熱過濾得濾液濃縮至干為固形物，將固形物置于250 mL圓底燒瓶中內(nèi)加一定量冰乙酸，小火加熱，回流并不斷攪拌，待固形物不再溶解后，將溶液趁熱過濾并將濾液減壓蒸餾除去溶劑可得混合氮基酸或向濾液內(nèi)滴加8～10倍體積丙酮，則氨基酸會立即析出，過濾［9］。

(2)自動氨基酸儀分析［10］

稱取一定量樣品，加入9倍體積1%的磺基水楊酸，10 000 r/min 離心 15 min，取上清液用 0.22 μm濾膜過濾，供上機使用。

1.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物

(1)頂空固相微萃取(SPME)方法［11-12］

先要將頂空固相微萃取頭插入氣相色譜進樣口，高溫老化至無雜峰。將5 mL魚露樣品放入15 mL封閉瓶中于50℃加熱平臺上保持10 min，將 SPME萃取頭插入瓶中，使之與樣品液面保持一定的距離，磁力攪拌速度為 100 r/min，50℃條件下萃取 40 min，與瓶內(nèi)氣體達到飽和。

(2)GC-MS參數(shù)條件

色譜柱:毛細管色譜柱 DB-WAX(60 m×0.25 mm，0.25 μm);進樣口溫度 250℃，SPME 插入進樣孔解吸 3 min;程序升溫:始溫 40℃，保持 4 min，以5℃/min升溫至90℃，再以10℃/min升溫至230℃，保持10 min;載氣(He)流速 1.0 mL/min，不分流。質(zhì)譜條件:接口溫度250℃，離子源溫度200℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍33～450 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍頭魚的基本成分

龍頭魚去除內(nèi)臟后，含有10.6%的蛋白質(zhì)，1.2%的脂肪。由此可看出，龍頭魚含有較豐富的蛋白質(zhì)和較低的脂肪含量，適合魚露的發(fā)酵。

2.2 魚露中氨基酸態(tài)氮含量

氨基酸態(tài)氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量。該指標越高，說明魚露中的氨基酸含量越高，鮮味越好。由圖1可知，5種魚露的氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵4.5個月后呈上升趨勢。未發(fā)酵時氨基酸態(tài)氮含量為0.02 g/100 mL，發(fā)酵4.5月后，接種TBN4的魚露氨基酸態(tài)氮含量最高，達到0.458 g/100 mL，對照組其次，為0.447 g/100 mL，這與龍頭魚肌肉中的內(nèi)源性蛋白酶密切相關(guān)。而在發(fā)酵過程中，嗜鹽菌一方面可以分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸，但另一方面也可能利用氨基酸充當?shù)悹I養(yǎng)物質(zhì)，從而使得前期生成的氨基態(tài)氮含量又進一步降低。TBN4菌株的體現(xiàn)最為明顯。通過Duncan法進行方差分析可知，TBN4與其他嗜鹽菌發(fā)酵的魚露氨基酸態(tài)氮含量存在顯著性差異(P＜0.05)，含量最高。

圖1 魚露發(fā)酵4.5個月后氨基酸態(tài)氮含量Fig.1 Amino nitrogen content of fish sauce fermented for 4.5 months

2.3 魚露中亞硝酸鹽含量

發(fā)酵4.5月后，對照組亞硝酸鹽含量3.964 mg/kg，接種TBN4魚露亞硝酸鹽含量3.189 mg/kg，接種TNN48魚露亞硝酸鹽含量3.542 mg/kg，接種9738魚露亞硝酸鹽含量3.085 mg/kg，接種RO2-11魚露亞硝酸鹽含量2.607 mg/kg，所有發(fā)酵樣品中的亞硝酸鹽含量微量，可忽略不計(國家標準為50 mg/kg)。可能原因一，高鹽環(huán)境能夠有效地抑制其他雜菌的生長，使得生產(chǎn)亞硝酸鹽的雜菌不能生長，一定程度上減少了亞硝酸鹽的產(chǎn)生;原因二，TBN4、TNN48、9738和RO2-11在生長過程中均能消耗亞硝酸鹽，尤其RO2-11具有較強的消耗亞硝酸鹽能力，見圖2。

為驗證推測，實驗進一步在嗜鹽菌液體培養(yǎng)基中加入一定量的亞硝酸鹽，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，結(jié)果如圖2所示。數(shù)據(jù)顯示4種嗜鹽古菌均具有消耗亞硝酸鹽的特性，特別是RO2-11具有較強的轉(zhuǎn)換能力，在培養(yǎng)1周后，培養(yǎng)基中的亞硝酸鹽基本就被消耗掉，這一特性對解決傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中容易產(chǎn)生亞硝酸鹽的問題將具有很好的應(yīng)用前景。

圖2 培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量的變化Fig.2 Changes of the medium in the nitrite content

2.4 魚露中總胺含量

由圖3可知，5組樣品在發(fā)酵4.5個月后總胺含量較原料魚大幅度地下降，其中接種TBN4的魚露中最低，為10.53 mgKOH/g，對照組的總胺含量最高，為12.32 mgKOH/g。原料魚總胺含量高，可能是因為魚中含有豐富的蛋白質(zhì)，尚未被發(fā)酵。對照組和接種嗜鹽菌的魚露中具有高鹽環(huán)境，可以抑制雜菌生長，避免腐敗使總胺含量較低。在接種嗜鹽菌的各魚露中，總胺含量相差不大(P＜0.05)。就總胺的含量降低而言，這4種嗜鹽菌均適合發(fā)酵魚露。

圖3 魚露發(fā)酵4.5個月總胺含量Fig.3 Total amine content of fish sauce fermented for 4.5 months

2.5 魚露中總酸含量

總酸含量的變化可能因為是發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的乳酸和產(chǎn)生的揮發(fā)性鹽基氮酸堿相互作用，最終動態(tài)平衡［13］。由圖4可知，發(fā)酵4.5個月后，各種魚露的總酸均呈上升趨勢。原料魚由于未發(fā)酵產(chǎn)生酸類物質(zhì)，因而總酸含量很低。而對照和4種嗜鹽古菌發(fā)酵魚露的總酸含量均顯著高于原料魚(P＜0.05)。其中，接種TBN4魚露中總酸含量最少(P＜0.05)，為3.32 g/kg，其他魚露的總酸含量均超過4.1 g/kg?？偹岷可仙赡芤驗槭窃诎l(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生游離氨基酸均會使得酸度升高，而同時如圖3和圖5所示，發(fā)酵樣品中胺類物質(zhì)和呈堿性的揮發(fā)性鹽基氮以及雜菌產(chǎn)生的氨類物質(zhì)的含量都非常少［14］，使總酸被中和的量也較少，因此在發(fā)酵過程中總酸含量是呈上升趨勢。

圖4 魚露發(fā)酵4.5個月后總酸含量Fig.4 Total acid content of fish sauce fermented for 4.5 months

2.6 魚露中揮發(fā)性鹽基氮含量

在魚露發(fā)酵4.5個月后，測定各組樣品的揮發(fā)性鹽基氮含量，結(jié)果如圖5。

圖5 發(fā)酵4.5個月后揮發(fā)性鹽基氮含量Fig.5 Content of volatile basic nitrogen of fish sauce fermented for 4.5 months

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)是指動物性食品由于酶和細菌的作用，在腐敗過程中，使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)。由圖5可看出，原料魚揮發(fā)性鹽基氮含量為0.040 g/100 g，發(fā)酵4.5個月后，各種魚露的揮發(fā)性鹽基氮的含量相比未發(fā)酵時，均有不同程度的上升(P＜0.05)，而一般魚露揮發(fā)性鹽基氮含量要求不高于0.25 g/100g，因此無論是對照組還是接菌組中的揮發(fā)性鹽基氮的含量都遠遠低于該值。對照組TVB-N含量上升可能是由于在發(fā)酵過程中，在雜菌的作用下產(chǎn)生少量的揮發(fā)性鹽氮。而在接種嗜鹽古菌的魚露中，由于嗜鹽古菌的存在，能夠有效的抑制雜菌的產(chǎn)生，能相對地減少鹽基氮的產(chǎn)生。接種TBN4魚露中揮發(fā)性鹽基氮含量的增多，可能是因為TBN4具有良好的蛋白酶活力，后期隨著酶的水解作用，氨基酸含量增加的同時也存在異常發(fā)酵即蛋白質(zhì)酸?。?2］，氨基酸再進一步分解為氨、三甲胺等揮發(fā)性鹽基含氮化合物［15］。

2.7 魚露中可溶性總氮含量

在魚露發(fā)酵4.5個月后，測定各種魚露的可溶性總氮含量，見圖6。

圖6 發(fā)酵4.5月后可溶性總氮含量Fig.6 Total soluble nitrogen content of fish sauce fermented for 4.5 months

可溶性總氮(TSN)能反映微生物群體利用氮源發(fā)酵情況，是反映魚體蛋白質(zhì)被分解程度的指標，主要包括游離的氨基酸態(tài)氮、小分子肽氮及可溶性蛋白氮等［14］。由圖6可知，龍頭魚經(jīng)過發(fā)酵4.5個月后，可溶性總氮含量比原料魚有較顯著地增加，但是對照和接入嗜鹽古菌的樣品相差不大。未發(fā)酵時，魚體的可溶性總氮含量為0.02 g/100mL，接種9738魚露的可溶性總氮含量為0.93 g/100mL，接種TBN4溶性總氮含量為1.13 g/100mL，而對照組魚露可溶性總氮含量為1.09 g/100mL。對照組中可溶性總氮含量上升可能是因為內(nèi)源性蛋白酶分解蛋白質(zhì)造成的。而接種嗜鹽古菌的魚露可能是因為具有產(chǎn)蛋白酶能力的嗜鹽古菌能將蛋白質(zhì)分解為氨基酸及肽類物質(zhì)，使得可溶性總氮含量上升。但同時嗜鹽古菌也可能利用可溶性氮充當營養(yǎng)物質(zhì)，使可溶性總氮又進一步降低。而接菌種的樣品中，TBN4魚露中可溶性總氮含量最高(P＜0.05)，可能是因為TBN4具有良好的蛋白酶活力，同時也可能是該菌株對產(chǎn)生的可溶性氮的消耗能力小于其他3株菌。

2.8 魚露中組胺含量

在魚露發(fā)酵4.5個月后，測定各種魚露的組胺含量，見圖7。

圖7 發(fā)酵4.5月后組胺含量Fig.7 Histamine content of fish sauce fermented for 4.5 months

食物中的組胺產(chǎn)生主要是由于幾種細菌激發(fā)組氨酸的脫羧酶活性［16］。若組胺被人體吸收，進入免疫系統(tǒng)，可能會引發(fā)過敏現(xiàn)象。由圖7可知，發(fā)酵4.5個月后，各種魚露內(nèi)的組胺含量均比未發(fā)酵時的組胺含量高。據(jù)孫國勇等［17］報告，在魚露前期發(fā)酵過程中，組胺含量開始會有所升高，而后下降。本實驗顯示原料魚組胺含量為2.81 mg/100 g(國家標準為50 mg/100 g)，可忽略不計。對照組中組胺含量最高，達到87.6 mg/100 g，遠高于原料魚(P＜0.05)。發(fā)酵4.5月后，接種TBN4魚露中的組胺含量最低，為2.43 mg/100 g顯著低于對照組和其他菌種發(fā)酵樣品(P＜0.05)。而其他3株古菌的組胺產(chǎn)生量也顯著低于對照組(P＜0.05)。原料魚組胺含量低，可能是因為組胺分解酶活性與鹽度有關(guān)［16］，20%鹽會降低組胺分解活力。而嗜鹽古菌可能具有降解組胺的能力［16］，且 TBN4＞ RO2-11＞TNN48＞9738。

2.9 魚露發(fā)酵后游離氨基酸的組成

在魚露發(fā)酵4.5個月后，測定各種魚露的游離氨基酸組成，如表1。

游離氨基酸的組成雖然不能體現(xiàn)某種特殊風(fēng)味，但卻是形成某種特殊風(fēng)味的基礎(chǔ)，氨基酸的組成對風(fēng)味的形成有重要的影響［18］。纈氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和谷氨酸為魚露鮮味氨基酸，而賴氨酸能影響魚露的滋味［19］。由表1可知，各魚露中游離氨基酸組成種類豐富，為人體提供了大量的必需氨基酸，具有豐富的營養(yǎng)價值［20］。其中，接種RO2-11魚露中所含游離氨基酸含量最低，為16.294 g/100mL，必需氨基酸和鮮味氨基酸組成較其他魚露含量低，賴氨酸含量也僅為2.179 g/100mL。接種TBN4和9738魚露中所含游離氨基酸含量較高，分別為29.226 g/100mL和29.927 g/100mL，必需氨基酸和鮮味氨基酸組成較其他魚露含量高，賴氨酸含量分別為3.160 g/100mL和3.113 g/100mL。與對照組相比，接種嗜鹽菌的魚露中含有天冬酰胺和半胱氨酸，天冬酰胺具有降血壓的功效，半胱氨酸對廣泛的毒物具有解毒功效。由此可見，利用TBN4和9738發(fā)酵魚露能夠得到全面豐富的氨基酸，并且必需氨基酸和鮮味氨基酸含量高，是理想的發(fā)酵劑。

表1 各魚露游離氨基酸組成 g/100mLTable 1 Free amino acid composition of each fish sauce

2.10 魚露揮發(fā)性風(fēng)味物

在魚露發(fā)酵4.5個月后，測定各種魚露的揮發(fā)性風(fēng)味物，如表2。

各魚露中均含有烷烯類物質(zhì)，但烴類化合物大多數(shù)分子質(zhì)量較大且閾值也較高，一般不能成為魚露氣味的主要貢獻體。魚露中醇類物質(zhì)含量較少，但醇類物質(zhì)閾值一般偏高(1.5 mg/L)，對魚露的風(fēng)味影響較小，但適量的醇類物質(zhì)能提高魚露的風(fēng)味。研究表明，酮類物質(zhì)與魚露干酪味的形成有關(guān)，但同樣也因為其閾值較高，對魚露風(fēng)味的影響較小。據(jù)研究有機酸能夠促進海鮮風(fēng)味物質(zhì)的釋放［14］。接種TNN48的魚露酸類物質(zhì)含量最高，占總量的26.6%，9738和RO2-11其次，含量為11.11%和13.62%。雖然含硫化合物含量較低，但因為其閾值也較低，故對于魚露特殊風(fēng)味的產(chǎn)生也有較大作用。然而只有接種TBN4的魚露中檢測到二甲基二硫和二甲基三硫的存在。其他類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中主要含有含氮化合

物，是氨基酸和糖類經(jīng)美拉德反應(yīng)而產(chǎn)生的具有肉香的化合物，主要為呋喃和咪唑［14］，而在接種TBN4的魚露中未檢測到含氮物質(zhì)的存在。

表2 各魚露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 2 Volatile flavor compounds of each fish sauce

3 結(jié)論

利用嗜鹽古菌發(fā)酵，一方面促進了風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，另一方面又能夠減少亞硝酸鹽和組胺等有害物質(zhì)的產(chǎn)生。在4種嗜鹽菌發(fā)酵的魚露中，接種TBN4的魚露中氨基酸態(tài)氮、可溶性總氮含量、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量最高，游離氨基酸含量豐富，而對人體健康會產(chǎn)生不良影響的組胺的含量最低;接種9738的魚露中氨基酸態(tài)氮含量最高;接種RO2-11的魚露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量較高，有害物質(zhì)組胺的含量較低。因此可考慮使用TBN4單獨發(fā)酵和9738、RO2-11與TBN4混合發(fā)酵魚露。

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