張開屏， 田建軍

（1.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院 食品工程系，內(nèi)蒙古 呼和浩特010070；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌是人體腸道中重要的益生菌，對維持宿主的微生態(tài)平衡和提高免疫功能起著極其重要的作用[1-3]。國外大量研究證實(shí)[4-7]，不同種類的乳酸菌具有降低膽固醇的效果。服用乳酸菌及其相關(guān)制品，可降低心血管病的發(fā)病率。因此從傳統(tǒng)發(fā)酵制品中篩選出安全高效的降膽固醇乳酸菌，可為今后益生菌制劑和功能性乳制品開發(fā)提供優(yōu)良菌種。

作者以分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中14株乳酸桿菌為研究對象，從中篩選出具有降膽固醇能力較高的乳酸菌，并進(jìn)行了乳酸菌種的鑒定和灌胃小白鼠的不良影響試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌14株。TPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、MRS-CHOL培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行配制；膽固醇、鄰苯二甲醛，巰基乙酸鈉、正己烷、冰醋酸：均為分析純；16S rDNA基因序列分析材料：參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行配制；清潔級純系昆明種小鼠：體重（20±2）g，雌雄各半，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，許可證號：SCXK（蒙2002-0001）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌液的調(diào)制 參照文獻(xiàn)[11]，對試驗(yàn)菌株進(jìn)行純化和革蘭氏染色鏡檢，MRS液體培養(yǎng)基37℃、24 h活化2代，按1%接種體積分?jǐn)?shù)接種MRS三角瓶液體培養(yǎng)（約 120 mL、37 ℃、24 h）然后無菌分裝于三支離心管中（約40 mL），按3 000 r/min離心10 min，棄上清液加滅菌生理鹽水約30 mL洗滌3次，按3 000 r/min離心10 min，棄上清液，獲得菌體細(xì)胞，再加20～30 mL滅菌生理鹽水，分光光度計(jì)調(diào)供試菌液活菌數(shù)約為3×109CFU/mL。

1.2.2 膽固醇的測定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分析天平精確稱量分析純膽固醇 50.00 mg，參照文獻(xiàn)[9，14]，用無水乙醇定容于50 mL的容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的膽固醇標(biāo)液。 精確吸取 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL容量瓶中，無水乙醇定容， 得到 10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 mg/L 的梯度溶液。分別取梯度溶液1.0 mL置于20 mL試管中，在通風(fēng)廚中抽干，然后加入2.0 mL鄰苯二甲醛溶液，磁力攪拌器振蕩使其充分溶解，10 min后加入1.0 mL的濃H2SO4磁力攪拌器振蕩混合均勻，室溫條件下放置10 min使其顯色，波長550 nm條件下測其OD值，分光光度計(jì)用2.0 mL鄰苯二甲醛溶液加入1.0 mL的濃H2SO4，混合均勻，室溫放置10 min調(diào)零。以膽固醇質(zhì)量百分比濃度為縱坐標(biāo)，550 nm條件下測的OD值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 膽固醇質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of cholesterol concentration

2）樣品處理及測定：參照文獻(xiàn)[12]，按1%的接種體積分?jǐn)?shù)將供試菌液在MRS-CHOL培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)24 h后，3 000 r/min離心10 min，取上清液為待測樣品，參照文獻(xiàn)[9-10，14]，取待測試驗(yàn)樣品0.5 mL，加無水乙醇3.0 mL和50%KOH 2.0 mL振蕩器混合均勻，60℃水浴恒溫10 min，冷卻后加正己烷5.0 mL，混合均勻，加雙蒸水3.0 mL后再充分混合，室溫靜置15 min使溶液分層，取正己烷層溶液2.0 mL抽干，加入鄰苯二甲醛溶液2.0 mL，室溫靜置10 min，加入1.0 mL濃H2SO4，混合均勻，放置10 min后，550 nm條件下測OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中膽固醇的質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算膽固醇降解率R及其單位菌株對膽固醇的去除效力E。

式中：S對照為對照樣上清液中膽固醇質(zhì)量濃度（μg/mL）；S接種為發(fā)酵上清液中膽固醇質(zhì)量濃度（μg/mL）；N 為乳酸菌數(shù)的對數(shù)值 lg（CFU/g）。

1.2.3 乳酸菌的生理生化試驗(yàn) 對篩選到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在生物顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，通過氧化氫酶試驗(yàn)、運(yùn)動性及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、糖發(fā)酵等生理生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定[15]。

參照文獻(xiàn)[11、13、16]，采用通用的 16S rDNA 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物后，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，進(jìn)而對乳酸菌進(jìn)行種的鑒定。

1.2.4 菌株N59-1的致病性試驗(yàn)

1）試驗(yàn)小鼠分組及給藥：將40只試驗(yàn)小白鼠隨機(jī)分為兩組，雄雌各半，每組20只，其中一組用于空白對照。以約3×109CFU/mL菌液分別灌胃雌雄小鼠，每次每只小鼠灌胃1.0 mL，在24 h內(nèi)灌胃2次，間隔8 h，取另一管用滅菌脫脂乳制備成相同濃度的菌懸液，空白對照組小鼠每次每只小鼠灌胃1.0 mL脫脂乳培養(yǎng)基，灌胃時間與試驗(yàn)組相同，連續(xù)觀察30 d，記錄觀察期間小鼠表現(xiàn)和死亡情況。

2）小鼠死亡記錄及組織切片的制作：參照文獻(xiàn)[17]，對死亡的小鼠進(jìn)一步做臟器有無病理變化試驗(yàn)和主要器官心、肝、腎、脾、賁門的組織切片觀察。若小鼠沒有死亡，試驗(yàn)結(jié)束時，則從每組中各取一只小鼠，對小白鼠進(jìn)行摘眼球取血，制備血片，將取血后的小白鼠脫臼致死，進(jìn)行組織切片觀察。

3）臟器系數(shù)的測定[18]：取血完畢脫臼處死小鼠，并小心分離出肝、腎，并立即于分析天平上稱量質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 降膽固醇乳酸菌的篩選

按1%的接種體積分?jǐn)?shù)，將供試菌液接種于MRS-CHOL培養(yǎng)基中，與對照樣一起在厭氧條件下，37℃培養(yǎng)24 h，分別測定其pH值、培養(yǎng)基中膽固醇的質(zhì)量濃度，并分別計(jì)算單位菌株對膽固醇的去除效力E和膽固醇降解率R，結(jié)果見圖2～3。圖中帶有相同子母，表示樣品之間差異不顯著（P＞0.05），不同子母表示樣品之間差異顯著（P＜0.05）。

由圖2可以看出 ，14株全部試驗(yàn)菌株對介質(zhì)中膽固醇都有脫除作用，除12和13號菌株外，其它12株菌株與對照樣相比差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)菌株對膽固醇的脫除力平均值為6.63 μg/lg（CFU/g），脫除力高于平均6.63 μg/lg（CFU/g）的菌株有7株，代號分別為 2、4、5、6、7、9、11，其中 11 號菌株 N59-1 對膽固醇的脫除力為 14.85 μg/lg（CFU/g），脫除力最高，代號15的菌株對膽固醇的脫除力與平均值相等，脫除力低于平均值 6.63 μg/lg（CFU/g）的菌株有 6 株，代號分別為 3、8、10、12、13、14。 菌株間對膽固醇脫除力的差異顯著性，如圖2中子母所示，含有不同子母，表示差異顯著（P＜0.05）。

圖2 乳酸菌對膽固醇的脫除效力Fig.2 Cholesterol removal effectiveness of lactobacillus from media

由圖3可以看出，14株全部試驗(yàn)菌株對介質(zhì)中膽固醇都有一定的降解作用，除12和13號菌株外，其它12株菌株與對照樣1相比差異顯著 （P＜0.05）。試驗(yàn)菌株對膽固醇的降解率平均值為15.48%，降解率高于平均值15.48%的菌株有7株，代 號 分 別 為 4、5、6、7、9、11、15， 其 中 11 號 菌 株N59-1對膽固醇的降解率為42.97%，降解率最高，降解率低于平均值15.48%的菌株有7株，代號分別為 2、3、8、10、12、13、14。 菌株間對膽固醇降解率的差異顯著性，如圖3中子母所示，含有不同子母，表示差異顯著（P＜0.05）。

結(jié)合圖2和圖3可以看出，菌株對膽固醇的脫除力和菌株對膽固醇的降解率有高度的相關(guān)性，降解率高的菌株，脫除力也高，代號11的菌株N59-1，對膽固醇的去除率R高達(dá)42.97%，同時單位菌株對膽固醇的去除效力E為14.85，與其它菌株相比差異顯著（P＜0.05），故N59-1可作為比較理想的篩選菌株。

圖3 乳酸菌對膽固醇的降解率Fig.3 Cholesterol removal rate of lactobacillus from media

2.2 乳酸菌的生理生化鑒定

2.2.1 乳桿菌屬的鑒定 采用嗜酸乳桿菌ATCC4356、保加利亞乳桿菌JCM1002和瑞士乳桿菌ATCC12278三株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對照菌株進(jìn)行乳桿菌屬的鑒定。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)對篩選的11號菌株N59-1進(jìn)行了鑒定，N59-1發(fā)酵葡萄糖但不產(chǎn)生氣體，屬同型乳酸發(fā)酵，細(xì)胞壁中不含有二氨基庚二酸，產(chǎn)生DL-乳酸，脫脂乳中產(chǎn)酸量為1.3%，試驗(yàn)結(jié)果見表1。根據(jù)表1及文獻(xiàn)[13]，可將試驗(yàn)菌株鑒定為乳酸菌的乳桿菌屬。

表1 乳桿菌的生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 1 Consequence on identification Lactobacillus physiological and biochemical experiment

2.2.2 乳桿菌種的鑒定 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可以看出，N59-1均分解木糖、核糖、蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、麥芽糖、纖維二糖等產(chǎn)酸，不利用肌醇、菊粉、七葉苷、扁桃苷、松三糖、纖維二糖。根據(jù)表2，參照文獻(xiàn)[4]可將N59-1歸為植物乳桿菌。

表2 糖發(fā)酵試驗(yàn)Table 2 Capacity of strains to make use of carbon source

用0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠對試驗(yàn)菌株N59-1的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物做電泳檢測，經(jīng)核酸染料染色后，在1 500 bp處出現(xiàn)熒光條帶，與預(yù)期一致，然后用回收的產(chǎn)物直接進(jìn)行16S rDNA序列測定。由菌株N59-1的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的乳桿菌屬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA/rDNA基因序列同源性百分比對比可知，菌株N59-1的16S rDNA序列與其它乳桿菌的16S rRNA/rDNA序列相似性均大于84%，是乳桿菌屬的菌株。而且菌株N59-1與L.plantarum的標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性為99.7%，可以認(rèn)為該菌株是一株Lb.plantarum。

2.3 菌株N59-1的致病性試驗(yàn)

2.3.1 菌株N59-1對小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 以3×109CFU/mL濃度菌液分別灌胃雌雄小鼠，每次每只小鼠灌胃1.0 mL，在24 h內(nèi)灌胃2次，間隔8 h，觀察7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部小鼠在整個試驗(yàn)過程中精神狀態(tài)、毛皮、膚色、飲水、進(jìn)食量、尿色和糞便與對照組小鼠的情況相同，均未發(fā)生任何不良反應(yīng)和死亡情況，表明試驗(yàn)菌株沒有引起小鼠的不良反應(yīng)。

2.3.2 菌株N59-1對小鼠血液的影響 試驗(yàn)觀察期30 d時，將每只小白鼠進(jìn)行摘眼球取血，制備血片。血片結(jié)果顯示，灌胃試驗(yàn)菌株的小白鼠與對照組的血片相似，細(xì)胞分布均勻，形態(tài)正常，無異常細(xì)胞，白細(xì)胞數(shù)量正常，沒有血小板和紅細(xì)胞聚集。

2.3.3 菌株N59-1對小鼠重要器官組織形態(tài)學(xué)的影響 試驗(yàn)觀察期30 d時，試驗(yàn)組小鼠肺臟、脾臟、腎臟、心臟與對照組相似。肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚；肺臟結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，未見明顯的病理學(xué)改變；脾臟結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，紅髓、白髓清楚可見，無增生，未見異常改變；腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)、腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞無濁腫或脂肪變性；心臟部位心室、心房、心肌纖維結(jié)構(gòu)清楚，橫紋清晰可見，為正常結(jié)構(gòu)，未見炎性細(xì)胞侵入，間質(zhì)未見異常。

2.3.4 菌株N59-1對小鼠臟器系數(shù)的影響 給食含N59-1菌液30 d稱重后，處死小鼠解剖檢查心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸等全身各臟器，肉眼觀察未發(fā)現(xiàn)明顯異常。取心、肝、肺、腎、脾等靶臟器，用濾紙吸去血液稱重，求臟器系數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 菌株N59-1對小鼠臟器系數(shù)的影響（X±S，n＝10）Table 3 Effect of strain N59-1 on organ coefficient in mice（X±S，n＝10）

由表3可知，小鼠心臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、肺臟系數(shù)、脾臟系數(shù)、腎臟系數(shù)、腦系數(shù)、卵巢或睪丸系數(shù)試驗(yàn)組與對照組無顯著變化（P＞0.05），可見含N59-1菌液對小鼠無不良影響。

3 結(jié)語

1）14株全部試驗(yàn)菌株對MRS-CHOL培養(yǎng)基中膽固醇都有一定的脫除作用，脫除率R在6.84%～42.97%之間，R的平均值為16.59%，其中12株菌株與對照樣相比差異顯著（P＜0.05），菌株N59-1對膽固醇的脫除率最高，數(shù)值為42.97%（P＜0.05）。

2）菌株N59-1與標(biāo)準(zhǔn)菌株L.plantarum的同源性約為99.7%，菌株N59-1可判定為L.plantarum。

3）在30 d的灌胃期內(nèi)，菌株N59-1在行為、血液和重要器官組織形態(tài)學(xué)、臟器系數(shù)方面，試驗(yàn)組與對照組無顯著差異（P＞0.05），可見含N59-1菌液對小鼠無不良影響。

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