苗玉志， 任 堯， 李 維， 葛方蘭

（四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101）

紅曲色素是由紅曲霉（Monascus spp.）經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的天然安全食用色素[1-2]，具有色澤鮮紅、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、口味自然等優(yōu)點(diǎn)，能抑菌[3]、抗氧化[4]、抑制脂肪酶活性[5]、調(diào)節(jié)血脂[6]、抗腫瘤[7-8]等功能，已被廣泛應(yīng)用于各種食品[9-10]。傳統(tǒng)的紅曲色素多以大米為底物發(fā)酵生產(chǎn)，其成本相對(duì)較高。近年來(lái)，為減少環(huán)境污染和降低生產(chǎn)成本，各種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物已被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)[11-12]。在紅曲色素的生產(chǎn)方面，同樣開(kāi)展了以低廉的玉米芯[13]、甘蔗渣[14]、葡萄渣[15]、土豆粉[16]等為底物的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，而以姬菇菇腳為底物進(jìn)行紅曲色素的生產(chǎn)經(jīng)檢索國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

姬菇菇腳是姬菇（Pleurotus cornucopiae）[17]在采收和加工過(guò)程中產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物。我國(guó)姬菇栽培量大，僅就四川金堂縣每年栽培規(guī)模就達(dá)3.9億袋，總產(chǎn)量為31.6萬(wàn)t，產(chǎn)值12億元[18]，而姬菇菇腳占整個(gè)鮮菇質(zhì)量的9%左右，目前菇腳基本上按垃圾廢棄物處理，造成一定程度上的環(huán)境污染和資源的極大浪費(fèi)。同時(shí)，菇腳同其子實(shí)體一樣富含多種營(yíng)養(yǎng)成分[19-20]，具有極高的使用價(jià)值。作為農(nóng)業(yè)廢棄物的姬菇菇腳，如果能夠用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素，不僅可以降低生產(chǎn)成本，解決廢棄菇腳所造成的環(huán)境污染，同時(shí)也可為菇腳變廢為寶開(kāi)辟新的途徑。

作者以姬菇菇腳為底物通過(guò)平板培養(yǎng)和液態(tài)發(fā)酵探究了姬菇菇腳對(duì)紫紅曲霉MR02菌絲生長(zhǎng)及紅曲色素生產(chǎn)的影響，以評(píng)估姬菇菇腳是否適合作為底物用于紅曲色素的發(fā)酵生產(chǎn)，所得結(jié)果可為以姬菇菇腳為底物生產(chǎn)紅曲色素的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：紫紅曲霉MR02（Monascus purpureous MR02）：作者所在實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；姬菇菇腳：收集于成都市金堂縣清江鎮(zhèn)姬菇種植基地。收集后經(jīng)清洗、風(fēng)干、粉碎成粉備用；NaNO3、KH2PO4、MgSO4：分析純；乳酸：食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

TH-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海鴻都公司；IS-RSV1型恒溫振蕩器：上海珂淮儀器公司；JD200-3電子天平：南北設(shè)備集團(tuán)；1850R超速離心機(jī)：上海博翔公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制 普通培養(yǎng)基：大米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、NaNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%、KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%、MgSO4質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%、pH 5.5～6.0（乳酸調(diào)）、平板添加瓊脂粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8%；菇腳培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基+質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的菇腳；液體培養(yǎng)基：按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制。所有培養(yǎng)基在121℃下滅菌20 min。

1.3.2 培養(yǎng)方法

1）平板培養(yǎng)：從母種斜面上接約0.5 cm2菌塊到活化平板上，30℃恒溫培養(yǎng)5 d，得到活化菌種，從活化平板上分別接約0.5 cm2圓形菌塊到普通平板和菇腳平板上，30℃恒溫培養(yǎng)，用于測(cè)定菌落直徑。

2）發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)：用10 mL無(wú)菌水洗出1管活化斜面菌種接到種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)72 h，得到種子液。以8%的接種體積分?jǐn)?shù)分別接種到裝有80 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液生物量和發(fā)酵液色素產(chǎn)量。

1.3.3 測(cè)定方法

1）平板菌絲增殖速率測(cè)定[21]：每天測(cè)定普通平板和菇腳平板上的菌落直徑，直至第10天。作3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值。

2）菌體生物量測(cè)定[18]：吸10 mL發(fā)酵液真空抽濾得到菌絲體，用蒸餾水洗菌體，去凈底物成分，所得菌體用180 W微波干燥15 min，然后在干燥器中冷卻15 min，反復(fù)干燥至恒重后稱(chēng)量。

3）色素色價(jià)測(cè)定[20-21]：取發(fā)酵液 10 mL，再加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇90 mL，靜置浸提4 h，浸提完畢后用濾紙過(guò)濾。濾液再以體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，以體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇作空白對(duì)照，用分光光度計(jì)法，在505、420 nm下測(cè)吸光度值，發(fā)酵液總色價(jià)（U/mL）為：（OD505+OD420）×稀釋倍數(shù)。

1.4 菌絲平均增殖速率的計(jì)算

式中，dt為第t天時(shí)的菌落直徑 （mm）；d0為剛接種時(shí)的菌落直徑（mm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板培養(yǎng)時(shí)姬菇菇腳對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將紫紅曲霉MR02分別接種在普通平板和姬菇菇腳平板培養(yǎng)基中進(jìn)行菌絲體增殖和產(chǎn)色能力培養(yǎng)，不同培養(yǎng)時(shí)間下菌絲增殖結(jié)果見(jiàn)表1。培養(yǎng)到第10天時(shí)的菌落和背面色澤見(jiàn)圖1。

表1 不同平板培養(yǎng)基中紫紅曲霉MR02的菌絲增殖速率Table 1 Growth rate of M.purpureous MR02 in different plate medium

圖1 普通培養(yǎng)基和菇腳培養(yǎng)基上的菌落和色澤Fig.1 Colony and color in general medium and P.cornucopiae stembase medium

由表1可知，紫紅曲霉MR02在普通平板上菌絲生長(zhǎng)相對(duì)較慢，接種后的第2天才開(kāi)始生長(zhǎng)，第6天后菌絲增殖速率明顯放緩，培養(yǎng)到第10天時(shí)，菌落直徑為46.3 mm，平均增殖速率為4.13 mm/d。由于在菇腳平板培養(yǎng)基中添加菇腳，改善了培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組分，接種后菌絲體僅需很短時(shí)間來(lái)適應(yīng)，在第1天就開(kāi)始生長(zhǎng)，持續(xù)增殖直到第10天，第10天時(shí)菌落直徑為59.7 mm，平均增殖速率為5.47 mm/d，同比菌落直徑增大了28.9%。

圖1顯示，普通平板培養(yǎng)基上的菌落明顯比菇腳平板培養(yǎng)基上的小，菌絲生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)不好，并且菌落中央有菌絲體老化（圖1 a），而在菇腳平板培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好，菌塊中央無(wú)菌絲體老化（圖1 b）。從平板背面的色素圈大小和顏色來(lái)看，在普通平板培養(yǎng)基上的色素圈小且顏色較淺 （圖1 c），在菇腳平板培養(yǎng)基上的色素圈明顯較大且顏色較深（圖1 d）。因此，在普通平板培養(yǎng)基中添加姬菇菇腳能夠提高紫紅曲霉MR02菌絲體的增殖速度和產(chǎn)色素能力。

2.2 液體培養(yǎng)時(shí)菇腳對(duì)菌體形態(tài)和產(chǎn)色素的影響

紫紅曲霉MR02搖瓶發(fā)酵時(shí)，菌絲體主要以菌絲球的形式存在，而菌絲球的大小及結(jié)構(gòu)對(duì)代謝產(chǎn)物合成有較大的影響[25]。在分別以普通液體培養(yǎng)基和添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的菇腳液體培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)8%的紫紅曲霉MR02，在30℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)192 h，測(cè)定菌絲球的外形尺寸，菌絲體生物量和發(fā)酵液色價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。

表2 紫紅曲霉MR02在兩種培養(yǎng)基中的發(fā)酵特點(diǎn)Table 2 Characters of M.purpureous MR02 shake flasks fermentation in two medium

圖2 紫紅曲霉MR02在普通培養(yǎng)基和菇腳培養(yǎng)基中的菌絲體形狀Fig.2 Mycelial pellets of M.purpureous MR02 in general and P.cornucopiae stembase fermention medium

由表2可知，紫紅曲霉MR02在菇腳液體培養(yǎng)基中的菌絲體生物量比在普通液體培養(yǎng)基中增加了41.5%，發(fā)酵液色價(jià)提高了25.1%。由圖2可知，在普通液體培養(yǎng)基（圖2a）中菌絲球直徑較大，數(shù)量較少，發(fā)酵液顏色較淡，這是由于在發(fā)酵后期，發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)不足造成了菌絲自溶的出現(xiàn)。而在添加有6%的姬菇粉液體培養(yǎng)基中（圖2b），在發(fā)酵后期菌絲球直徑較小，數(shù)量較多，發(fā)酵液顏色較深，這是因?yàn)楣侥_的添加使得發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)較充足，能夠繼續(xù)維持菌絲體的生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，促進(jìn)色素更多的合成，最終提高了色素產(chǎn)量。

2.3 以菇腳為底物的培養(yǎng)對(duì)菌絲體生物量和產(chǎn)色素的影響

大米是紅曲色素生產(chǎn)中的最佳底物，但其成本較高，基于產(chǎn)量和生產(chǎn)成本的考慮，作者采用大米和姬菇菇腳為底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、1%、2%、3%的大米粉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、3%、6%、9%、12%的菇腳發(fā)酵培養(yǎng)液中，接種體積分?jǐn)?shù)8%的紫紅曲霉MR02，在30℃、150 r/min培養(yǎng)192 h，測(cè)得的菌絲體生物量色素產(chǎn)量見(jiàn)圖3。

圖3 大米和菇腳用量對(duì)生物量和色素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of P.cornucopiae stembase and rice doses on biomass and pigment yield

圖3結(jié)果顯示，以不同配比的菇腳和大米為底物培養(yǎng)紫紅曲霉MR02時(shí)，對(duì)菌絲體生物量和色素產(chǎn)量均有顯著影響?？梢钥闯?，所有以姬菇菇腳和大米為共同底物培養(yǎng)的菌絲體生物量和色素產(chǎn)量均比以單一姬菇菇腳或大米為底物的產(chǎn)量要高。在大米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的不同菇腳配比中，在菇腳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的發(fā)酵液中色素產(chǎn)量最大，為85.97 U/mL，而菇腳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，發(fā)酵液菌絲體生物量最大，為6.65 g/L；而在所有配比中，大米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和菇腳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的發(fā)酵液中，色素產(chǎn)量最大，為90.1 U/mL。同時(shí)在僅以姬菇菇腳為底物培養(yǎng)紫紅曲霉MR02時(shí)，雖然菌絲體生物量和色素產(chǎn)量明顯低于以大米粉和姬菇菇腳為共同底物的培養(yǎng)，但有不同數(shù)量的菌絲體和紅曲色素產(chǎn)生，尤其以質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%菇腳為底物培養(yǎng)192 h的菌絲體的生物量和色素產(chǎn)量最高，分別為5.21 g/L和67.5 U/mL，這一結(jié)果也表明，只以姬菇菇腳為底物加適量的氮素和營(yíng)養(yǎng)鹽能夠用于培養(yǎng)紫紅曲霉MR02生產(chǎn)紅曲色素。

2.4 菇腳對(duì)紫紅曲霉MR02生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響

在分別以普通培養(yǎng)基、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%菇腳的普通培養(yǎng)基以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%純菇腳液體培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)8%的紫紅曲霉MR02，在30℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定在不同培養(yǎng)時(shí)間下的菌絲體生物量和色素產(chǎn)量來(lái)評(píng)估姬菇菇腳對(duì)紫紅曲霉MR02的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)影響，菌絲生長(zhǎng)和色素生產(chǎn)特性曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。

圖4 紫紅曲霉MR02在不同液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和產(chǎn)色曲線(xiàn)圖Fig.4 Curves ofgrowth and pigmentyield of M.purpureous MR02 in different liquid medium

從圖4可知，紫紅曲霉MR02在這三種液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性雖然都符合多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)曲線(xiàn)規(guī)律，但是其菌絲體生物量和色素產(chǎn)量隨培養(yǎng)基底物的不同而變化趨勢(shì)明顯。在添加6%菇腳的普通液體培養(yǎng)基中，紫紅曲霉MR02完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需時(shí)間為72 h，穩(wěn)定期持續(xù)了96 h，菌絲體生物量和色素產(chǎn)量也相對(duì)最高；在普通液體培養(yǎng)基中，雖然紫紅曲霉MR02完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需時(shí)間同樣為72 h，但由于營(yíng)養(yǎng)組分的差異，其穩(wěn)定期只維持了72 h，菌絲體生物量和紅曲色素產(chǎn)量相對(duì)較低；而在只以姬菇菇腳（12%）為底物的液體培養(yǎng)基中，紫紅曲霉MR02完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需時(shí)間為120 h，穩(wěn)定期僅僅維持了48 h，而菌絲體生物量和紅曲色素產(chǎn)量最少。如果將姬菇菇腳作為底物培養(yǎng)紫紅曲霉MR02生產(chǎn)紅曲色素，會(huì)出現(xiàn)生產(chǎn)周期長(zhǎng)、色素產(chǎn)量低等問(wèn)題，因而需要對(duì)其培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.5 菇腳質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌絲體生物量和產(chǎn)色素的影響

在以質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、9%、12%、15%的菇腳為底物，接種體積分?jǐn)?shù)8%的紫紅曲霉MR02，在30℃、150 r/min，經(jīng)不同時(shí)間培養(yǎng)后測(cè)定的紫紅曲霉MR02的菌絲體生物量和色素產(chǎn)量見(jiàn)圖5。

從圖5可知，在以不同菇腳為底物的發(fā)酵液中，紫紅曲霉MR02在接種后第24小時(shí)開(kāi)始生長(zhǎng)，直到第120小時(shí)菌絲體生物量達(dá)最大，而后進(jìn)入穩(wěn)定期，在第192小時(shí)后菌絲體生物量開(kāi)始降低。同時(shí)，自第72小時(shí)開(kāi)始，發(fā)酵液緩慢變紅，開(kāi)始產(chǎn)生紅曲色素，直到發(fā)酵的第216小時(shí)達(dá)到最大，不論是從最大菌絲體生物量和最高色素產(chǎn)量獲得的時(shí)間來(lái)看，都比采用大米和菇腳為共同底物的培養(yǎng)明顯延后。同時(shí)，菌絲體生物量和發(fā)酵液色價(jià)與菇腳質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有明顯的相關(guān)性，在以6%的菇腳為底物的發(fā)酵液中，其生物量和色素色價(jià)明顯較低；在分別以9%、12%和15%的菇腳為底物的培養(yǎng)液中，生物量相對(duì)較高并非常接近。在菇腳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，培養(yǎng)到第144小時(shí)，具有最大的生物量，為5.52 g/L，而在培養(yǎng)到第216 h，具有最大的紅曲色素產(chǎn)量，為72.92 U/mL。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)菇腳對(duì)紫紅曲霉MR02的生物量和色素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of stembase concentrations on biomass and pigment yield of M.purpureous MR02

3 結(jié)語(yǔ)

在普通培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的菇腳粉，通過(guò)平板培養(yǎng)紫紅曲霉MR02后，其平均增殖速率為5.47 mm/d，培養(yǎng)10 d后菌落直徑與在普通培養(yǎng)基上相比增大了28.9%，通過(guò)液體培養(yǎng)紫紅曲霉MR02后，菌絲生物量增加41.5%，發(fā)酵液色價(jià)同比提高25.1%。

分別以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)菇腳和大米的配比為底物培養(yǎng)紫紅曲霉MR02時(shí)，雖然以菇腳為單一底物的培養(yǎng)明顯低于以大米粉或大米和菇腳為共同底物的培養(yǎng)，但均有不同數(shù)量的菌絲體生物量和紅曲色素產(chǎn)生，在以12%菇腳為底物培養(yǎng)192 h時(shí)，菌絲體生物量和色素產(chǎn)量分別為5.21 g/L和67.5 U/mL，這表明只以姬菇菇腳為底物能夠用于培養(yǎng)紫紅曲霉MR02生產(chǎn)紅曲色素。

在只以姬菇菇腳為底物培養(yǎng)紫紅曲霉MR02的生長(zhǎng)曲線(xiàn)符合多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)曲線(xiàn)規(guī)律，但其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，穩(wěn)定期較短，從而使得紫紅曲霉MR02的菌絲體生物量和紅曲色素生成量明顯低于以大米或大米和姬菇菇腳為共同底物培養(yǎng)的產(chǎn)量。

在以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的菇腳為底物對(duì)紫紅曲霉MR02進(jìn)行培養(yǎng)，不同用量的菇腳發(fā)酵產(chǎn)生不同的菌絲體生物量和色素產(chǎn)量，最大產(chǎn)量在姬菇菇腳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，培養(yǎng)到第144小時(shí)的生物量（5.52 g/L）和培養(yǎng)到第216小時(shí)的紅曲色素 （72.92 U/mL）。這表明菌絲體生物量和紅曲色素產(chǎn)量與菇腳底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有明顯的相關(guān)性，因而需要對(duì)姬菇菇腳促進(jìn)紅曲霉菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)色機(jī)理以及培養(yǎng)基組分進(jìn)行全面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

因此，以紫紅曲霉MR02為出發(fā)菌株，以姬菇菇腳為底物發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素是切實(shí)可行的。下一步擬對(duì)用姬菇菇腳為底物發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，有望進(jìn)一步提高以姬菇菇腳為底物發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的色價(jià)，為工業(yè)化利用姬菇菇腳生產(chǎn)紅曲色素提供技術(shù)支持。

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