王 津， 周志江， 韓 燁， 陳 穎， 范 寰

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津南開(kāi) 300072；2.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津西青 300384；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津西青 300384）

益生元是指能使腸道中有益菌活化的物質(zhì)，它不能被宿主消化吸收卻能選擇性地促進(jìn)腸道中有益菌的生長(zhǎng)、繁殖，主要包括低聚糖、多糖、天然植物提取物、蛋白水解物、多元醇等（Mookiah等，2014；于曉燕和朱京慈，2008）。 目前飼料中添加的主要是低聚糖類益生元。在實(shí)踐應(yīng)用中低聚糖與益生素配合使用，促進(jìn)益生菌在腸道的增殖及定植，抑制腸道腐敗菌的生長(zhǎng)（Liong和Shah，2005）。本試驗(yàn)探討低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、殼寡糖、異麥芽糖和甘露寡糖等對(duì)乳酸片球菌體外增殖和抑菌效果影響，為乳酸片球菌與低聚糖配伍使用提供一定的理論科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）PA003由天津大學(xué)食品科學(xué)系食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌（Lister monocytogenes）CVCC1591，購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察中心。

1.2 低聚糖 低聚木糖含量 （以干物質(zhì)計(jì)）≥90%；低聚果糖含量（以干物質(zhì)計(jì)）≥95%；低聚半乳糖含量（以干物質(zhì)計(jì)）≥95%；殼寡糖含量（以干物質(zhì)計(jì)）≥95%；異麥芽糖含量 （以干物質(zhì)計(jì)）≥90%；甘露寡糖含量（以干物質(zhì)計(jì)）≥90%。以上低聚糖均為市購(gòu)。

1.3 培養(yǎng)基 MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母提取物 0.5 g，胰蛋白胨1 g，牛肉膏1 g，磷酸氫二鉀0.2 g，乙酸鈉0.5 g，檸檬酸銨0.2 g，硫酸鎂0.058 g，硫酸錳 0.025 g，吐溫-80 0.1 g，水 100 mL，pH 6.5。

試驗(yàn)培養(yǎng)基：分別以低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、殼寡糖、異麥芽糖和甘露寡糖取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源配制而成，其他成分同基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

TSYEB培養(yǎng)基：葡萄糖0.25 g，胰蛋白胨1.7 g，酵母提取物0.6 g，大豆蛋白胨0.3 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀 0.25 g，水 100 mL，pH 7.1 ～ 7.5。

1.4 菌株活化 將乳酸片球菌PA003以0.1%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。使用平板計(jì)數(shù)細(xì)菌的濃度，調(diào)整其濃度為109cfu/mL，備用。抑菌試驗(yàn)指示菌為單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌，以1%接種于TSYEB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。使用平板計(jì)數(shù)細(xì)菌的濃度，調(diào)整其濃度為109cfu/mL，備用。

1.5 不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌增殖的影響分別以2%（m/V）的低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、殼寡糖、異麥芽糖和甘露寡糖取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基的葡萄糖為處理組，葡萄糖培養(yǎng)基為對(duì)照組，采用平板計(jì)數(shù)法考察不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌增殖的影響。將活化后的乳酸片球菌菌懸液，按10倍梯度稀釋法稀釋，選擇合適的稀釋度，涂布接種于預(yù)先傾注好的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基及試驗(yàn)培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。取出各平板，觀察菌落生長(zhǎng)情況，分別計(jì)數(shù)各稀釋度平板表面生長(zhǎng)的菌落數(shù)，以菌落數(shù)為50～300的平板為統(tǒng)計(jì)對(duì)象，計(jì)算乳酸片球菌增殖的菌落數(shù)（cfu/mL），每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.6 不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果的影響 分別以2%（m/V）的低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、異麥芽糖和甘露寡糖取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基的葡萄糖為處理組，葡萄糖培養(yǎng)基為對(duì)照組，采用牛津杯法測(cè)定不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果（丁成為等，2007）。將活化后的乳酸片球菌發(fā)酵液以1%接種量接種于MRS液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基及試驗(yàn)培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌作為指示菌，測(cè)量抑菌圈直徑，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.7 不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌增殖的影響 分別以0.5%、1%、2%、3%、4%（m/V）的低聚果糖取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖作為試驗(yàn)培養(yǎng)基。采用平板計(jì)數(shù)法考察不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌增殖的影響。將活化后的乳酸片球菌菌懸液，按10倍梯度稀釋法稀釋，選擇合適的稀釋度，涂布接種于預(yù)先傾注好的試驗(yàn)培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。菌落計(jì)數(shù)方法同1.5。

1.8 不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果的影響 分別以 0.5%、1%、2%、3%、4%（m/V）的低聚果糖取代葡萄糖添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。采用牛津杯法測(cè)定不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果。將活化后的乳酸片球菌發(fā)酵液以1%接種量接種于不同濃度低聚果糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌作為指示菌，測(cè)量抑菌圈直徑，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.9 乳酸片球菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 以2%（m/V）的低聚果糖取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖作為試驗(yàn)培養(yǎng)基，葡萄糖培養(yǎng)基為對(duì)照組。將活化后的乳酸片球菌發(fā)酵液以1%接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基和試驗(yàn)培養(yǎng)基。37℃恒溫培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣測(cè)定其吸光度值，吸光度測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌增殖的影響不同種類低聚糖在相同的添加量下對(duì)乳酸片球菌增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌的增殖影響效果不同。乳酸片球菌基本上不能利用殼寡糖。與對(duì)照組相比，低聚果糖和低聚半乳糖均促進(jìn)了乳酸片球菌的增殖。低聚果糖能被乳酸片球菌選擇性發(fā)酵，發(fā)酵后的菌體濃度可達(dá)到（3.08±0.54）×109cfu/mL，約是葡萄糖對(duì)照組的1.38倍，差異顯著（P＜0.05）。低聚半乳糖也能促進(jìn)乳酸片球菌生長(zhǎng)，但是與葡萄糖對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果的影響 不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果的影響結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，不同種類低聚糖發(fā)酵乳酸片球菌對(duì)單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌均有一定的抑制作用，抑菌圈直徑為10.08～14.21 mm。與葡萄糖對(duì)照組相比，低聚果糖能明顯增加乳酸片球菌抑菌性，抑菌圈直徑達(dá)到14.21 mm（P＜0.05）；而低聚半乳糖作為碳源，對(duì)乳酸片球菌本身抑菌特性無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

表1 不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌增殖的影響 cfu/mL

表2 不同種類低聚糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果的影響 mm

2.3 不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌增殖的影響 不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，低聚果糖濃度在0.5%～2%，隨著低聚果糖濃度的升高，乳酸片球菌菌落數(shù)相應(yīng)升高。此外，培養(yǎng)基中低聚果糖的含量并不是越高越好，以2%濃度的增殖效果最好，乳酸片球菌菌落數(shù)達(dá)到最大。而低聚果糖濃度達(dá)到3%時(shí)，乳酸片球菌菌落數(shù)反而下降。當(dāng)?shù)途酃菨舛冗_(dá)到4%時(shí)，菌落數(shù)已經(jīng)降至（0.33±0.19）×109cfu/mL。這可能是由于低聚果糖濃度過(guò)高形成高滲透壓環(huán)境，菌體細(xì)胞脫水，從而抑制菌體生長(zhǎng)。因此，2%濃度的低聚果糖為乳酸片球菌增殖的最佳濃度。

2.4 不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果的影響 不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果的影響結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，低聚果糖濃度在0.5%～2%，隨著低聚果糖濃度的升高，抑菌圈直徑相應(yīng)變大。而低聚果糖濃度達(dá)到3%時(shí)，抑菌圈直徑反而略有下降。當(dāng)?shù)途酃菨舛冗_(dá)到4%時(shí)，抑菌圈直徑明顯變小，說(shuō)明，乳酸片球菌的抑菌特性受到嚴(yán)重抑制。這可能是由于高滲透壓的低聚果糖對(duì)細(xì)菌的脫水作用，抑制了乳酸片球菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致乳酸片球菌菌素和乳酸生成明顯減少（王晶等，2013）。因此，低聚果糖濃度為2%時(shí)，乳酸片球菌達(dá)到最大抑菌活性。

表3 不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌增殖的影響

表4 不同濃度低聚果糖對(duì)乳酸片球菌抑菌效果的影響

2.5 乳酸片球菌生長(zhǎng)曲線的建立 乳酸片球菌液體培養(yǎng)后的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，在0～24 h，與葡萄糖相比，低聚果糖作為碳源，乳酸片球菌能迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適應(yīng)期有所縮短。培養(yǎng)12 h后達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，低聚果糖組的OD值也略高于葡萄糖組。因此低聚果糖對(duì)乳酸片球菌體外生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，優(yōu)于葡萄糖作碳源時(shí)的生長(zhǎng)效果。

圖1 乳酸片球菌生長(zhǎng)曲線

3 討論

微生物的生長(zhǎng)可用比濁法、直接涂布法、傾注培養(yǎng)和OD值等多種方法進(jìn)行測(cè)定，本試驗(yàn)采用直接涂布法測(cè)定菌落形成單位（cfu/mL）。雖然比較繁瑣，但因低聚木糖、殼寡糖溶解性不好，會(huì)有輕微的渾濁現(xiàn)象，因此比濁法和OD值的方法都會(huì)影響測(cè)定的可靠性，因此選用直接涂布法進(jìn)行細(xì)菌生長(zhǎng)的測(cè)定。

低聚糖由于其分子間結(jié)合位置及結(jié)合類型特殊，飼喂后不能被單胃動(dòng)物自身分泌的消化酶分解。單胃動(dòng)物消化道寄生著大量微生物，這些微生物具有切斷低聚糖末端糖苷鍵的酶，因此低聚糖可被有益微生物利用。低聚糖可選擇性促進(jìn)腸道有益菌繁殖，發(fā)酵后產(chǎn)生乳酸、乙酸、短鏈脂肪酸等酸性物質(zhì)。乳酸可直接作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被機(jī)體吸收，還可作為殺菌劑抑制腸道中病原菌的增殖；短鏈脂肪酸可通過(guò)降低腸道pH值，抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)通過(guò)降低腸道氧化還原電位，調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)，間接阻止病原菌在腸道上皮細(xì)胞的粘附定殖。低聚糖與腸上皮寡糖結(jié)構(gòu)受體相似，可與病原菌的外源凝集素特異性結(jié)合，使病原菌不能在腸道上粘附，而隨低聚糖通過(guò)消化道排出體外（武香玉等，2013）。

低聚果糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增殖雙歧桿菌和乳桿菌的作用 （項(xiàng)明潔等，2005）。有研究報(bào)道，低聚果糖能防止早期斷奶犢牛腸道萎縮，維持腸道正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高犢牛免疫性能（邰秀林等，2009）。低聚果糖能促進(jìn)乳桿菌和雙歧桿菌的增殖并抑制腸桿菌和腸球菌的增殖 （杭鋒等，2009）。本試驗(yàn)也得到類似結(jié)果，低聚果糖可促進(jìn)乳酸片球菌的增殖，并對(duì)單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌有很好的抑菌活性。因此本試驗(yàn)結(jié)果為制備復(fù)合型動(dòng)物微生態(tài)制劑-合生元提供了理論和科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

低聚果糖對(duì)乳酸片球菌體外生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用。培養(yǎng)基中低聚果糖添加比例為2%時(shí)，能明顯促進(jìn)乳酸片球菌生長(zhǎng)，發(fā)酵后的菌體濃度可達(dá)到（3.08±0.54）×109cfu/mL；同時(shí)也能明顯提高乳酸片球菌抑菌性，抑菌圈直徑達(dá)到（14.21±0.30）mm。 與葡萄糖相比，低聚果糖作為碳源，乳酸片球菌能迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適應(yīng)期有所縮短。

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