徐亞霞，李程碑，楊俊偉

(陜西省石油化工研究設(shè)計(jì)院，陜西 西安 710054)

卡松(KATHON)的有效成分為5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMIT)與2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MIT)，CMIT/MIT 的比值在2.5 ～4 之間，用硝酸鎂作穩(wěn)定劑，統(tǒng)稱卡松，主要應(yīng)用在日化、化妝品、涂料等行業(yè)的防腐殺菌。本院研究改用其它非二價(jià)鹽作穩(wěn)定劑的卡松(以下稱無(wú)鹽卡松)，避免了大量穩(wěn)定劑(硝酸鎂)引起的涂料、日化等產(chǎn)品絮凝，結(jié)塊等“鹽簇效應(yīng)”的不良現(xiàn)象。

近年來(lái)，微生物對(duì)包括卡松在內(nèi)的常用防腐劑產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，引起了業(yè)內(nèi)人士的高度重視。王春華［1］等指出，工業(yè)殺菌劑的廣泛使用和其種類(lèi)的不斷增加，使得抗藥性微生物菌株和具有多重抗藥性的菌株不斷出現(xiàn)，給工業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。李程碑等［2］呼吁，使用日化防腐劑時(shí)應(yīng)注意減輕微生物抗藥性的產(chǎn)生，并不斷推出新的復(fù)合型防腐劑。使用復(fù)合防腐劑，是減輕微生物產(chǎn)生抗藥性的有效途徑之一。將幾種抑菌化學(xué)品配合使用，不僅可以拓寬抗菌譜，有效提高抗菌抑菌效果，而且可以使每種抗菌組分之間通過(guò)增效作用，增強(qiáng)使用效能，從而降低添加量。微生物同時(shí)對(duì)兩種或兩種以上的防腐劑產(chǎn)生抗藥性的概率極低，特別是幾種不同作用機(jī)理的防腐劑復(fù)合使用時(shí)，微生物對(duì)防腐劑產(chǎn)生抗藥性的幾率更低［3］。另外，使用復(fù)合防腐劑是防腐抑菌殺菌自身的需要。單一種類(lèi)抗菌化合物，通常只對(duì)某一特定菌群具有殺滅或抑制效果，而造成日化、涂料等產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的微生物種類(lèi)眾多，因此含有單一種類(lèi)抗菌化合物的防腐劑不能滿足防腐防霉的實(shí)際需求。僅含一種抗菌化合物的防腐劑在實(shí)際使用中還存在適用pH 值、最低抑制濃度和抑菌范圍等多方面限制，故而推崇使用復(fù)合防腐劑。

卡松對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用較差，容易產(chǎn)生抗藥性而達(dá)不到防腐效果［4］，然而假單胞菌在土壤和空氣中大量存在，是涂料、日化等化工品中常見(jiàn)的重要有害菌，所以很難控制［5］。卡松也容易出現(xiàn)皮膚過(guò)敏現(xiàn)象。1，3-二羥甲基-5，5-二甲基海因(DMDMH)是一種甲醛緩釋劑型防腐劑，在日化方面已得到了廣泛的應(yīng)用，因其同時(shí)具有很好的空間保護(hù)功能，在涂料中也越來(lái)越受到重視［6］。DMDMH 對(duì)細(xì)菌(包括銅綠假單胞菌)的抑制效率很高，而且不容易出現(xiàn)皮膚過(guò)敏，允許的添加量可高達(dá)0.6%，而DMDMH 對(duì)真菌的抑制效率則相對(duì)較差［2］，由于其添加量太小時(shí)起不到防腐作用，加量大時(shí)成本升高，而且會(huì)帶來(lái)甲醛超量問(wèn)題，故而常常與卡松復(fù)合使用，通常DMDMH 與卡松的比例為(300∶1)～(1 000∶1)［7］。鑒于此，本文針對(duì)無(wú)鹽卡松與DMDMH 的復(fù)配展開(kāi)研究，為開(kāi)發(fā)一種使用成本低，更可靠安全的日化、涂料防腐劑作基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

無(wú)鹽卡松、DMDMH 均為自制;營(yíng)養(yǎng)瓊脂、真菌培養(yǎng)基、瓊脂粉、營(yíng)養(yǎng)肉湯為生化試劑;氯化鈉，分析純;菌種有銅綠假單胞菌(CGMCC 1.2464)、金黃色葡萄球菌(CGMCC 1. 0089)、黑曲霉(CGMCC 3.3928)、白色念珠菌(CGMCC 2.2086);雙圈牌定性濾紙。

DHP-9272 型恒溫培養(yǎng)箱;160 L 霉菌培養(yǎng)箱;BXM-30 型高壓滅菌器;JM-A1001 型電子天平;30-A2 型生物安全柜。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抑菌圈實(shí)驗(yàn)將直徑1 cm 的滅菌濾紙置于一定濃度的防腐劑溶液中浸泡10 min，取出，自然風(fēng)干后備用。將滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿中，待凝固后，用無(wú)菌棉簽蘸取一定濃度的菌懸液，均勻涂抹在培養(yǎng)基上，然后將風(fēng)干的濾紙片貼于其上，37 ℃，24 h 培養(yǎng)，測(cè)量其抑菌圈大小。

1.2.2 增效實(shí)驗(yàn)取5 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液加入試管中，121 ℃、20 min 滅菌。取1 mL 一定濃度的防腐劑溶液加至其中，再加0.1 mL 菌懸液，搖勻，置37 ℃培養(yǎng)。分別在24，48，72，112 h 觀察其是否渾濁，并計(jì)算增效系數(shù)SI 值。

1.2.3 挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)參照美國(guó)藥典(第21 版)微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)檢測(cè)防腐劑效果的方法，取自制受試樣30 g，加入菌懸液攪拌均勻，使每克受檢樣品最終分別含細(xì)菌量為5 ×106個(gè)、含真菌量為3 ×105，置于28 ℃培養(yǎng)箱。在接菌的0，7，14，21，28 d 分別取樣分析，取3 g 樣品，加到27 mL 滅菌生理鹽水，混勻，然后再用滅菌生理鹽水按10 倍依次稀釋。按平板傾注法計(jì)數(shù)受試品中含菌量，計(jì)算受試樣品是否通過(guò)挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度無(wú)鹽卡松、DMDMH 抑制細(xì)菌與真菌生長(zhǎng)對(duì)比

選取防腐劑無(wú)鹽卡松與DMDMH 的不同濃度，測(cè)試其對(duì)綠膿桿菌和白色念珠菌的抑菌圈大小，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同作用濃度下無(wú)鹽卡松與DMDMH 抑菌圈大小對(duì)比Fig.1 Inhibition zone contrast of nonsalt KATHON and DMDMH with different concentration

由圖1 可知，兩種防腐劑在使用濃度為0.2%～1.5%范圍內(nèi)對(duì)細(xì)菌具有抑菌性，在使用濃度為0.4% ～1.8%范圍內(nèi)對(duì)真菌具有抑菌性，并且在該范圍內(nèi)，二者的抑菌性均隨著防腐劑濃度的增大而呈增強(qiáng)趨勢(shì);同一使用濃度的無(wú)鹽卡松抑制細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)效果大于同一使用濃度的DMDMH;同一使用濃度的無(wú)鹽卡松抑制細(xì)菌生長(zhǎng)效果大于抑制真菌生長(zhǎng)效果，同樣，DMDMH 抑制細(xì)菌生長(zhǎng)效果也大于抑制真菌生長(zhǎng)效果。

2.2 無(wú)鹽卡松與DMDMH 協(xié)同增效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)效果

將無(wú)鹽卡松、DMDMH 稀釋至一定濃度，使其加至5 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中達(dá)到一定的濃度值，然后加入裝有5 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，再加入0.1 mL綠膿桿菌菌懸液，搖勻，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，在規(guī)定時(shí)間觀察其是否生長(zhǎng)。以48 h 為基準(zhǔn)，以渾濁試管之后的第一個(gè)清亮試管的防腐劑濃度作為防腐劑的最小抑菌濃度，作為計(jì)算協(xié)同增效系數(shù)SI 的依據(jù)，協(xié)調(diào)增效系數(shù)SI 計(jì)算方法［8］如下:

SI=Qa/QA+Qb/QB

式中 QA——無(wú)鹽卡松單獨(dú)作用時(shí)的最小抑菌濃度;

Qa——混合防腐劑最小抑菌濃度時(shí)無(wú)鹽卡松的濃度;

QB——DMDMH 單獨(dú)作用時(shí)的最小抑菌濃度;

Qb——混合防腐劑最小抑菌濃度時(shí)DMDMH的濃度。

當(dāng)SI 值＞1 時(shí)，表明兩種防腐劑具有拮抗作用;當(dāng)SI 值=1 時(shí)具有相加作用;當(dāng)SI 值＜1 時(shí)表明兩種防腐劑具有協(xié)同增效作用，并且SI 越小說(shuō)明增效作用越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 無(wú)鹽卡松與DMDMH 對(duì)綠膿桿菌的協(xié)同增效抑制實(shí)驗(yàn)Table 1 Synergy coefficient experiment of nonsalt KATHON and DMDMH inhibit Pseudomonas aeruginosa

由表1 可知，無(wú)鹽卡松與DMDMH 對(duì)細(xì)菌具有明顯的協(xié)同增效抑制作用，增效系數(shù)SI 為0.59 ～0.86;當(dāng)無(wú)鹽卡松與DMDMH 分別以0.24 與83.3(mg/L)復(fù)配時(shí)，具有最佳協(xié)同增效效果。以此作為依據(jù)，針對(duì)細(xì)菌和真菌混合菌的增效效果作進(jìn)一步研究。

2.3 無(wú)鹽卡松與DMDMH 協(xié)同增效抑制細(xì)菌和真菌的混合菌生長(zhǎng)效果

用綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的混合菌菌懸液代替綠膿桿菌菌懸液，同法做無(wú)鹽卡松與DMDMH 的協(xié)同增效實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 無(wú)鹽卡松與DMDMH 對(duì)細(xì)菌和真菌的混合菌的協(xié)同增效抑制實(shí)驗(yàn)Table 2 Synergy coefficient experiment of nonsalt KATHON and DMDMH inhibit bacteria and epiphyte

由表2 可知，無(wú)鹽卡松與DMDMH 對(duì)細(xì)菌和霉菌的混合菌具有明顯的協(xié)同增效抑制作用，增效系數(shù)SI 為0.58 ～0.88;當(dāng)無(wú)鹽卡松與DMDMH 分別以0.60 與200(mg/L)復(fù)配時(shí)，具有最佳協(xié)同增效效果。

2.4 無(wú)鹽卡松與DMDMH 復(fù)配體系的挑戰(zhàn)試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證無(wú)鹽卡松與DMDMH 復(fù)配體系的防腐效果，選自制洗潔凈為研究對(duì)象，添加無(wú)鹽卡松與DMDMH 有效成分之比為1.21 ∶133.3 的復(fù)配體系，使洗潔精中防腐劑的有效含量分別為12.1 mg/L無(wú)鹽卡松和1 333 mg/L DMDMH(工業(yè)實(shí)際應(yīng)用推介使用量為實(shí)驗(yàn)室研究最低抑菌濃度的10 倍)，再分別添加綠膿桿菌和白色念珠菌菌懸液，做挑戰(zhàn)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 無(wú)鹽卡松與DMDMH 復(fù)配體系挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Challenging experiment result of the combined system of nonsalt KATHON and DMDMH

由表3 可知，添加無(wú)鹽卡松與DMDMH 的洗潔凈通過(guò)細(xì)菌和真菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明無(wú)鹽卡松與DMDMH 的1.21∶133.3 (mg/L)的復(fù)配體系，具有優(yōu)良的長(zhǎng)效抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的功效。

無(wú)鹽卡松除了具有常規(guī)卡松抑菌性能強(qiáng)、抗菌譜廣等特點(diǎn)外，還具有常規(guī)卡松不具有的很大優(yōu)勢(shì)，該研究為無(wú)鹽卡松系列產(chǎn)品的推出奠定了基礎(chǔ)，在無(wú)鹽卡松與DMDMH 1.21∶133.3 (mg/L)的復(fù)配體系中稍加合適的穩(wěn)定劑等輔料，就可作為一款新的效價(jià)更高的優(yōu)質(zhì)防腐殺菌劑在日化等工業(yè)市場(chǎng)推廣應(yīng)用。除了主要應(yīng)用于化妝品防腐外，同時(shí)還可作為日化、油漆、涂料及木材等領(lǐng)域的防腐劑，是一種應(yīng)用前景廣闊的值得大力開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，具有很高的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

3 結(jié)論

(1)無(wú)鹽卡松、DMDMH 二者都具有抑制細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)效果，并且二者的抑菌性在一定濃度范圍內(nèi)隨著防腐劑濃度的增大而呈增強(qiáng)趨勢(shì);同一使用濃度的無(wú)鹽卡松抑制細(xì)菌生長(zhǎng)效果大于抑制真菌生長(zhǎng)效果;同樣，DMDMH 抑制細(xì)菌生長(zhǎng)效果也大于抑制真菌生長(zhǎng)效果;但同一使用濃度的無(wú)鹽卡松抑制細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)效果大于同一使用濃度的DMDMH。

(2)當(dāng)無(wú)鹽卡松與DMDMH 分別以0.24 mg/L與83.3 mg/L 復(fù)配時(shí)，對(duì)細(xì)菌具有最佳協(xié)同增效抑制效果;當(dāng)無(wú)鹽卡松與DMDMH 分別以0.60 mg/L與200 mg/L 復(fù)配作用時(shí)，對(duì)細(xì)菌和霉菌的混合菌具有最佳協(xié)同增效抑制效果。

(3)無(wú)鹽卡松與DMDMH 的1. 21 ∶133. 3(mg/L)的復(fù)配體系，具有優(yōu)良的長(zhǎng)效抑制細(xì)菌及真菌生長(zhǎng)的功效。

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