梅鑫東 曾江南 蔣柏泉

(1.江西省化學(xué)工業(yè)學(xué)校，江西南昌 330012;2.南昌大學(xué)環(huán)化學(xué)院，江西 南昌 330031)

膠原蛋白具有良好的生物相容性、低抗原性和免疫原性以及良好的輔助細(xì)胞再生功能，已被廣泛用于食品、生物醫(yī)學(xué)、制藥和化妝品等領(lǐng)域［1］。膠原蛋白在食品工業(yè)中主要用于肉制品和冷凍食品的改良劑、飲料的澄清劑、乳制品和糕點(diǎn)糖果的添加劑，人造腸衣、食品包裝膜和食品涂層材料等。魚鱗是魚加工過程中產(chǎn)生的廢物，但因其含有豐富的膠原蛋白，已經(jīng)成為潛在的膠原蛋白新的原料資源［2］。綜合利用魚鱗不僅可以減少污染排放，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，還可以獲得好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。近年來，從魚鱗和其它魚加工廢棄物(魚皮、魚骨、魚刺、魚內(nèi)臟等)中提取膠原蛋白受到人們極大關(guān)注，并取得了較大的進(jìn)展［3－9］。從魚鱗中提取膠原蛋白主要有酸法和酶法兩種，較之酸法提取，酶法提取具有水解速度快、提取時(shí)間短、提取率高和不產(chǎn)生污染等優(yōu)點(diǎn)。近年來，中國報(bào)道的酶法提取魚鱗膠原蛋白的文獻(xiàn)中采用的酶催化劑主要有胃蛋白酶［1，4，10－13］和 alcalase 堿性蛋白酶［14－16］，研究的對(duì)象主要是草魚、鯉魚、鰱魚、鯽魚和羅非魚魚鱗等。與胃蛋白酶和alcalase堿性蛋白酶比較，木瓜蛋白酶是一種在堿性、中性和酸性條件下均能分解蛋白質(zhì)的蛋白酶，可在比較溫和的操作條件下工作，但是目前報(bào)道用木瓜蛋白酶提取魚鱗膠原蛋白的文獻(xiàn)極少，只有黃煥等［16］報(bào)道了木瓜蛋白酶從青魚魚鱗中提取膠原蛋白的工藝研究(以水解度為目標(biāo)值)。鳙魚是中國“四大家魚”之一，其產(chǎn)量隨著人們生活的需要而逐年提高。不同魚種的魚鱗的結(jié)構(gòu)和成分存在一定的差異，因此其提取的工藝條件也會(huì)有所不同。但目前尚未發(fā)現(xiàn)其它有關(guān)從鳙魚魚鱗中提取膠原蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬以鳙魚魚鱗為研究對(duì)象，選擇木瓜蛋白酶為催化劑，在pH=6的環(huán)境下從魚鱗中提取膠原蛋白。以膠原蛋白提取率為目標(biāo)值對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并通過紅外光譜的測(cè)試，對(duì)所提取產(chǎn)品的特征進(jìn)行分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚魚鱗:來源于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場;

L-羥脯氨酸(L-hydroxyproline):BR級(jí)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

木瓜蛋白酶(Papain):BR級(jí)，U≥1 000 U/mg，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;

鹽酸:AR級(jí)，上海安達(dá)化工有限公司;

硫酸:AR級(jí)，西隴化工股份有限公司;

檸檬酸和氫氧化鈉:AR級(jí)，天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平:FA2104型，上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司;

超級(jí)恒溫器:501型，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;

可見分光光度計(jì):722S型，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱:01A-1型，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠;

傅立葉變換紅外光譜儀:Nicolet 5700型，美國熱電尼高力公司。

1.3 提取方法

1.3.1 魚鱗脫鈣預(yù)處理 首先，用剪刀將一定量的魚鱗剪成碎片，用蒸餾水洗凈，放在烘箱中干燥一定時(shí)間后浸入濃度為0.1 mol/L的 Na2CO3溶液中，磁力攪拌6 h(溶液/魚鱗之比為10∶1(V∶m))并重復(fù)3次，用蒸餾水將鱗片洗凈直至洗滌水呈中性，以除去非膠原性蛋白和色素等雜質(zhì)。然后，將上述處理后的鱗片浸于質(zhì)量濃度為10%的檸檬酸溶液中(溶液/魚鱗之比為20∶1(V∶m))，磁力攪拌60 min，此過程中魚鱗所含羥基磷灰石中的鈣離子與檸檬酸生成絡(luò)合物溶于溶液中，達(dá)到魚鱗脫鈣的目的。

1.3.2 膠原蛋白提取 每次試驗(yàn)用1 g魚鱗原料，加5 mL一定質(zhì)量濃度的木瓜蛋白酶。選擇膠原蛋白提取率為目標(biāo)值，液固比、提取時(shí)間、酶濃度和提取溫度為主要考察因素，并根據(jù)提取過程的實(shí)際要求、初步的試驗(yàn)摸索以及參考的相關(guān)文獻(xiàn)［15］，設(shè)定各因素的水平值范圍見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels of factors for orthogonal test

1.4 膠原蛋白提取率的測(cè)定

L-羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征氨基酸，通過測(cè)定樣品中L-羥脯氨酸的含量估算魚鱗膠原蛋白的提取率。

1.4.1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和線性回歸方程建立 準(zhǔn)確稱取100 mg L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解于盛有0.01 mol/L鹽酸溶液的100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容。測(cè)定時(shí)，從中移取10 mL放入另一100 mL的容量瓶中后定容，得到濃度為10 mg/mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。

分別吸取 1.0，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL 的 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液放入6個(gè)100 mL的容量瓶后定容，并計(jì)算出濃度，然后用可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度［17］，繪制出L-羥脯氨酸濃度―吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性化后得回歸方程:

式中:

y——吸光度;

x——羥脯氨酸濃度，mg/mL。

1.4.2 提取率計(jì)算 將提取液移至100 mL容量瓶中后用蒸餾水定容。準(zhǔn)確吸取10 mL該溶液并移至錐形瓶中，加入3 mol/L的硫酸溶液30 mL，水解16 h(105℃下)后移至50 mL的容量瓶中定容。準(zhǔn)確吸取10 mL溶液移至50 mL容量瓶中，先用NaOH溶液(20%)調(diào)至pH=6.0，然后定容，測(cè)吸光度，代入上述回歸方程，求得L-羥脯氨酸濃度，再由式(2)計(jì)算以1 g魚鱗為基準(zhǔn)的L-羥脯氨酸的提取率η:

式中:

η——L-羥脯氨酸的提取率，%;

c——L-羥脯氨酸濃度，mg/mL;

w——魚鱗質(zhì)量，g。

1.5 紅外光譜分析

從膠原蛋白樣品中取微量烘至絕干(105℃下)，壓制成透明薄片后在傅立葉變換紅外光譜儀4 000～500 cm－1光譜范圍內(nèi)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

按六因素五水平正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，并采用正交設(shè)計(jì)助手計(jì)算機(jī)軟件分析處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，其結(jié)果見表2。

2.1.1 直觀分析 由表2可知，試驗(yàn)號(hào)8、15和19的因素水平組合獲得的提取率非常接近且最大，但考慮到經(jīng)濟(jì)成本等因素，水平組合A2B3C4D5應(yīng)為25組試驗(yàn)中較理想的組合，其對(duì)應(yīng)的提取率為9.66%。由表2的極值R的大小順序可知，提取時(shí)間對(duì)提取率的影響程度最大，其次是溫度、酶濃度和液固比。

2.1.2 因素水平趨勢(shì)分析 表2中的k值表示任一因素的某一水平獲得的5次不同提取率的平均值［18］。

由表2中因素液固比和酶濃度的k值可知，在選定的液固比和酶濃度的水平范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)于液固比20∶1(V∶m)和酶濃度2.5%均有一k的(最大)極值出現(xiàn)(分別為6.666和6.650)，說明所選定的該兩個(gè)因素的水平值范圍是合理和有效的，沒有再作調(diào)整的可能。由因素提取時(shí)間和提取溫度的k值可知，在選定的提取時(shí)間和提取溫度的水平值范圍內(nèi)，k值均隨提取時(shí)間和提取溫度的升高而增大，如果進(jìn)一步提高提取時(shí)間和提取溫度，則可獲得更大的提取率，這就意味著原來選定的提取時(shí)間和提取溫度的水平上限值都偏低，有必要進(jìn)一步提高。但從因素提取時(shí)間的k值得知，提取時(shí)間超過36 h后，k值隨時(shí)間的加長而提高的幅度逐漸變緩，考慮到生產(chǎn)能力和經(jīng)濟(jì)效益等因素，對(duì)提取時(shí)間的上限值不再作調(diào)整，并取36 h為合理值。從因素提取溫度的k值可看出，28℃后，繼續(xù)提高溫度仍可使提取率得到較大幅度的提高，但考慮到膠原蛋白的變性溫度較低(＜30℃)，不宜在高溫下操作，因此，限定溫度上限值為28℃，對(duì)其不再作調(diào)整。通過以上分析，根據(jù)各因素水平的k值大小，可得到較為理想的水平組合A3B4C4D5，該水平組合在表2中未出現(xiàn)，于此條件下重復(fù)3次平行試驗(yàn)，得提取率的平均值為1 1.64%。顯然，與水平組合A2B3C4D5相比，水平組合A3B4C4D5可獲得更高的提取率，因此最終確定其為本試驗(yàn)的最佳因素水平組合，即液固比20∶1(V∶m)、提取時(shí)間3 6 h、木瓜蛋白酶濃度2.5%和提取溫度28℃。

2.1.3 方差分析 采用正交設(shè)計(jì)助手計(jì)算機(jī)軟件對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test

由表3可知，由于4個(gè)因素的F值均小于F0.1值，所以4個(gè)因素的顯著性均為不顯著，但根據(jù)各因素F值的大小可判斷它們對(duì)提取率影響程度的相對(duì)大小順序?yàn)樘崛r(shí)間、提取溫度、酶濃度和液固比，這與直觀分析的結(jié)果是一致的。

2.2 紅外掃描結(jié)果

圖1 樣品紅外光譜譜圖Figure 1 Infrared spectrum of sample

由圖1可知:3 300 cm－1處有酰胺A帶的—NH和 —OH的伸縮振動(dòng)峰，說明有H鍵存在于肽鏈之間;2 928 cm－1處有 酰 胺 Ⅱ 帶 的 C—H 伸 縮 振 動(dòng) 峰;1654 cm－1和1 536 cm－1處分別有酰胺Ⅰ帶的C═O伸縮振動(dòng)峰和酰胺Ⅱ帶的N—H彎曲振動(dòng)峰，這是膠原蛋白的特征吸收峰;1 454 cm－1和 1 243 cm－1處分別有—CH2—或—CH3的彎曲振動(dòng)吸收峰和C—O伸縮振動(dòng)峰，表明樣品中的 —CH2—基團(tuán)(或—CH3基團(tuán))和C—O基團(tuán)均未被破壞，三股螺旋結(jié)構(gòu)完整性保持良好。以上分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)I型膠原蛋白的紅外光譜圖基本吻合［19］。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用木瓜蛋白酶成功地從鳙魚魚鱗中提取了膠原蛋白，并獲得了較高的提取率。產(chǎn)品經(jīng)紅外光譜表征基本符合I型膠原蛋白的特征。與酸性(胃蛋白酶)和堿性(alcalase)酶催化劑比較，木瓜蛋白酶可在比較溫和的條件下(p H=6)操作，這更加有利于后期產(chǎn)品的純化和廢液的處理。通過正交試驗(yàn)的直觀分析和因素水平趨勢(shì)分析對(duì)初步設(shè)定的各因素水平值進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定的最佳工藝參數(shù)為:液固比20∶1(V∶m)、提取時(shí)間 36 h、木瓜蛋白酶濃度2.5%和提取溫度28℃，在此條件下，膠原蛋白提取率高達(dá)1 1.64%(提取的膠原蛋白的質(zhì)量占魚鱗原料質(zhì)量的百分?jǐn)?shù))。下步工作將通過紫外光譜和氨基酸成分測(cè)定對(duì)產(chǎn)品特征進(jìn)一步分析和鑒定，并對(duì)產(chǎn)品的熱變性溫度、乳化性、吸濕性、保濕性和起泡性等性能進(jìn)行研究。

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