胡 毅 張俊智 黃 云 肖調(diào)義 鐘 蕾* 米海峰 彭慧珍

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128;2.通威股份有限公司，成都 610041)

豆粕因蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成相對(duì)平衡，被廣泛用作水產(chǎn)飼料中的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)源，然而，近幾年豆粕價(jià)格持續(xù)高漲，使飼料的成本大幅提高。與豆粕相比，棉籽粕具有明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，其價(jià)格不到豆粕的2/3，并且具有產(chǎn)量大、蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成較平衡等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)際上棉籽粕產(chǎn)量?jī)H次于豆粕，我國(guó)棉籽粕年產(chǎn)量達(dá)到650萬(wàn)t，是僅次于豆粕、菜籽粕的第三大植物蛋白質(zhì)源。因此，利用相對(duì)廉價(jià)的棉籽粕部分或全部替代飼料中的豆粕具有較大的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。目前，關(guān)于棉籽粕部分或全部替代飼料中的豆粕已在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)［1－2］和鱸魚(yú)(Lateolabrax japonicus)［3］等魚(yú)類(lèi)上有相關(guān)研究。然而，由于棉籽粕中游離棉酚的存在，影響了棉籽粕在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用和推廣。棉籽粕中游離棉酚能同賴(lài)氨酸結(jié)合導(dǎo)致賴(lài)氨酸利用率降低，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響［4］，此外，游離棉酚能降低飼料中鐵的吸收，引起動(dòng)物紅細(xì)胞數(shù)量下降［5］，并且游離棉酚被吸收入體內(nèi)存積于肝臟、腎臟和肌肉組織中，引起累積性中毒［6－7］，以上不利因素均影響了其在水產(chǎn)飼料中的添加量。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，高棉籽粕飼料會(huì)降低青魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)和免疫力，降低青魚(yú)血液中紅細(xì)胞(RBC)和白細(xì)胞(WBC)的數(shù)量，造成肝臟中游離棉酚累積，使肝功能受損［8］。鑒于此，本試驗(yàn)擬通過(guò)在高棉籽粕飼料中補(bǔ)充補(bǔ)充鐵和賴(lài)氨酸，探討在高棉籽粕飼料中補(bǔ)充鐵和賴(lài)氨酸能否改善青魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)，降低游離棉酚的毒性，改善肝功能，降低肝臟和肌肉中游離棉酚含量，為提高飼料中棉籽粕的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以商品飼料配方為基礎(chǔ)，配制一種以魚(yú)粉、豆粕(粗蛋白質(zhì)含量為43%)為蛋白質(zhì)源的實(shí)用飼料作為豆粕對(duì)照飼料，在上述飼料的基礎(chǔ)上以棉籽粕(粗蛋白質(zhì)含量為42%)等蛋白質(zhì)替代100%的豆粕作為高棉籽粕飼料，并在高棉籽粕飼料中分別用 0.342%的晶體賴(lài)氨酸(有效含量 79%)、0.115%的七水硫酸亞鐵以及0.342%的晶體賴(lài)氨酸+0.115%的七水硫酸亞鐵等量替代面粉，分別作為高棉籽粕補(bǔ)充賴(lài)氨酸飼料、高棉籽粕補(bǔ)充鐵飼料、高棉籽粕補(bǔ)充鐵和賴(lài)氨酸飼料。試驗(yàn)所配制的5種試驗(yàn)飼料等氮等能，其中賴(lài)氨酸補(bǔ)充量以豆粕對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)，鐵補(bǔ)充量參照Barros等［9］的試驗(yàn)(游離棉酚與亞鐵離子比例為1∶1)，試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼料原料經(jīng)粉碎過(guò)40目篩，微量成分采取逐級(jí)擴(kuò)大法混合均勻，采用雙螺旋壓條機(jī)擠壓出2.0 mm粒徑飼料顆粒，于陰涼處風(fēng)干后置于－20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

續(xù)表1

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用青魚(yú)由湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所魚(yú)類(lèi)原種場(chǎng)提供，為同批次人工孵化魚(yú)苗，試驗(yàn)前在室外水泥池中投喂商品飼料暫養(yǎng)20 d后，挑選個(gè)體大小均勻、體格健壯青魚(yú)于室內(nèi)水族箱(容積300 L)中投喂豆粕對(duì)照飼料馴化1周，饑餓24 h后，挑選規(guī)格一致、初始平均體重為(7.01±0.05)g 的青魚(yú)進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。試驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)分成6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾，以重復(fù)為單位放養(yǎng)于水族箱內(nèi)。日投餌量為體重的3%～5%，分 3次投喂(08:00、12:00、16:00)，每日換水 1 次，換水量占總體積的1/3并清除箱內(nèi)糞便，每日充氣12 h，保證溶氧濃度在5.0 mg/L以上，水溫(28±3)℃，pH 7.32±0.42，養(yǎng)殖時(shí)間持續(xù) 8 周。

1.3 樣品收集與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)分別對(duì)各水族箱中青魚(yú)進(jìn)行記數(shù)、稱(chēng)重，計(jì)算存活率和特定生長(zhǎng)率。每個(gè)水族箱隨機(jī)取5尾青魚(yú)供內(nèi)臟指數(shù)、肝胰指數(shù)和肥滿(mǎn)度測(cè)定。各指標(biāo)計(jì)算公式如下:

式中:N0為初始魚(yú)數(shù)(尾);Nt為終末魚(yú)數(shù)(尾);Wf為平均終末體重(g);Wi為平均初始體重(g);t為飼養(yǎng)時(shí)間(d);Wh為肝胰臟重(g);Wv為內(nèi)臟重(g);Wq為魚(yú)體重(g);Lt為魚(yú)體長(zhǎng)(cm)。

1.3.2 血液生理生化指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，用1 mL無(wú)菌注射器尾靜脈采血，用移液槍吸取部分血液，用RBC稀釋液稀釋200倍，Neubauer計(jì)數(shù)板計(jì)RBC數(shù)量，其余血液置于無(wú)菌離心管中，4℃靜置12 h，3 500 r/min離心15 min，取上層血清置于－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)、谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶 (glutamic pyruvic transaminase，GPT)、溶菌酶(lysozyme，LZM)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活力采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定;血清補(bǔ)體4(complement 4，C4)含量采用浙江伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.3.3 飼料和魚(yú)體中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)水族箱隨機(jī)取5尾青魚(yú)，－20℃冰凍保存作為全魚(yú)樣品。飼料和魚(yú)體樣品中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定參照 AOAC(1995)［10］的方法。其中，水分含量的測(cè)定采用105℃烘箱干燥恒重法，粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏定氮法，粗脂肪含量的測(cè)定采用索氏抽提法，粗灰分含量的測(cè)定采用550℃灼燒法，總能水平的測(cè)定采用氧彈式熱量計(jì)法。

1.3.4 組織中游離棉酚含量測(cè)定

組織游離棉酚含量參照GB/T 17334—1998所述方法測(cè)定。取青魚(yú)肌肉和肝臟組織，稱(chēng)鮮重，冷凍干燥后稱(chēng)干重，記算水分含量，磨碎。稱(chēng)取0.200 0 g左右干樣，加入 5 mL無(wú)水乙醇，振蕩2 min，靜置分層，取上清，離心并過(guò)濾(0.45 μm 濾膜)，得到試樣。取試樣10μL，用高效液相色譜儀測(cè)定游離棉酚含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備:準(zhǔn)確吸取1.00、2.00、5.00、8.00 mL 的 50 μg/mL 棉酚標(biāo)準(zhǔn)液于10.0 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，取10μL液相色譜測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。組織中游離棉酚含量查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)既得。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)差異顯著(P＜0.05)時(shí)，則采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 高棉籽粕飼料補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

由表2可知，各組間青魚(yú)的存活率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與豆粕對(duì)照組相比，高棉籽粕組青魚(yú)的特定生長(zhǎng)率顯著降低(P＜0.05);在高棉籽粕飼料中單一補(bǔ)充賴(lài)氨酸、鐵及同時(shí)補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵均能一定程度提高青魚(yú)的特定生長(zhǎng)率，其中同時(shí)補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵組(高棉籽粕+賴(lài)氨酸+鐵組)與高棉籽粕組差異顯著(P＜0.05)，與豆粕對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。各組間青魚(yú)的內(nèi)臟指數(shù)和肝胰指數(shù)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與豆粕對(duì)照組比，高棉籽粕組青魚(yú)的肥滿(mǎn)度顯著降低(P＜0.05)，在高棉籽粕飼料中單一補(bǔ)充賴(lài)氨酸、鐵及同時(shí)補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵均能一定程度提高青魚(yú)的肥滿(mǎn)度，但仍顯著低于豆粕對(duì)照組(P＜0.05)。

表2 高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of high cottonseed meal diet supplemented with lysine and iron on growth of juvenile black carp

2.2 高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)血液生理生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與豆粕對(duì)照組相比，高棉籽粕飼料顯著降低了血液RBC數(shù)量(P＜0.05)，在高棉籽粕飼料中補(bǔ)充鐵能一定程度提高血液RBC數(shù)量，且高棉籽粕+賴(lài)氨酸+鐵組血液RBC數(shù)量與豆粕對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。棉籽粕替代豆粕顯著降低了青魚(yú)血清 C4含量(P＜0.05)，而在高棉籽粕飼料中補(bǔ)充鐵能顯著提高血清C4含量(P＜0.05)，且單一補(bǔ)充鐵組(高棉籽粕+鐵組)血清C4含量與豆粕對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與豆粕對(duì)照組相比，高棉籽粕飼料顯著降低了青魚(yú)血清T-SOD活力(P＜0.05)，高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸后其活力顯著高于高棉籽粕組(P＜0.05)，且與豆粕對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。棉籽粕替代豆粕顯著降低了青魚(yú)血清LZM 活力(P＜0.05)，與高棉籽粕組相比，高棉籽粕飼料中單一補(bǔ)充賴(lài)氨酸、鐵及同時(shí)補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵均顯著提高了血清LZM活力(P＜0.05)，但仍都顯著低于豆粕對(duì)照組(P＜0.05)。棉籽粕替代豆粕顯著提高了青魚(yú)血清GOT和GPT活力(P＜0.05)，與高棉籽粕飼料組相比，高棉籽粕飼料中補(bǔ)充鐵和賴(lài)氨酸后顯著降低了血清GOT和GPT活力(P＜0.05)，且單一補(bǔ)充鐵組血清GOT、GPT活力與豆粕對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表3 高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)血液生理生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of high cottonseed meal diet supplemented with lysine and iron on blood physiological-biochemical indexes of juvenile black carp

2.3 高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)體成分及組織中游離棉酚含量的影響

由表4可知，各組間魚(yú)體水分和粗灰分含量差異不顯著(P＞0.05)，而棉籽粕替代豆粕影響了魚(yú)體粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量，使魚(yú)體粗脂肪含量顯著提高(P＜0.05)，粗蛋白質(zhì)含量顯著降低(P＜0.05);與高棉籽粕飼料組相比，高棉籽粕飼料中單一補(bǔ)充鐵和賴(lài)氨酸對(duì)魚(yú)體粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)，但同時(shí)補(bǔ)充鐵與賴(lài)氨酸能顯著降低魚(yú)體粗脂肪含量(P＜0.05)，顯著提高魚(yú)體粗蛋白質(zhì)含量(P＜0.05)，且與豆粕對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與高棉籽粕飼料組相比，高棉籽粕飼料中補(bǔ)充鐵顯著降低了肌肉和肝臟中游離棉酚含量(P＜0.05)，而單一補(bǔ)充賴(lài)氨酸對(duì)肝臟中游離棉酚含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

表4 高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵對(duì)青魚(yú)體成分及組織中游離棉酚含量的影響Table 4 Effects of high cottonseed meal diet supplemented with lysine and iron on body composition and tissue free gossypol content of juvenile black carp

3 討論

3.1 高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

本研究結(jié)果表明，棉籽粕替代豆粕顯著降低了青魚(yú)特定生長(zhǎng)率，與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果一致［11］。高棉籽粕飼料降低青魚(yú)的生長(zhǎng)性能與棉籽粕中游離棉酚相關(guān)，研究表明，飼料中高含量的游離棉酚能降低尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)［12］和鸚鵡魚(yú)(Amphilophus)［13］的生長(zhǎng)和飼料利用率。游離棉酚主要通過(guò)以下2個(gè)方面來(lái)影響?hù)~(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)和飼料利用率:1)游離棉酚在腸道能與鐵結(jié)合降低飼料中鐵的利用率［14］;2)游離棉酚能結(jié)合飼料中的賴(lài)氨酸，降低飼料中賴(lài)氨酸的利用率［15］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在高棉籽粕飼料中同時(shí)補(bǔ)充鐵和賴(lài)氨酸能顯著提高青魚(yú)的特定生長(zhǎng)率，與 Barros 等［9］和 Robinson［16］在 斑 點(diǎn) 叉 尾(Ictalurus punctatus)、Ei-Saidy 等［12］在尼羅羅非魚(yú)上的研究結(jié)果相似，其原因一方面可能與添加的外源晶體賴(lài)氨酸與棉籽粕中游離棉酚結(jié)合，減少了游離棉酚與內(nèi)源賴(lài)氨酸的結(jié)合，從而提高了飼料中賴(lài)氨酸的利用率有關(guān)［16］，另一方面可能與添加的外源鐵與游離棉酚在腸道內(nèi)結(jié)合減少了游離棉酚的吸收，降低了游離棉酚對(duì)機(jī)體的毒性有關(guān)［17－18］。高棉籽粕飼料顯著降低青魚(yú)的肥滿(mǎn)度，補(bǔ)充鐵和賴(lài)氨酸后能一定程度提高肥滿(mǎn)度，可能是因?yàn)橛坞x棉酚與賴(lài)氨酸結(jié)合后抑制了與蛋白質(zhì)及脂肪代謝相關(guān)酶的合成，補(bǔ)充外源鐵和賴(lài)氨酸緩解了游離棉酚與賴(lài)氨酸的結(jié)合，促進(jìn)了與蛋白質(zhì)代謝和脂肪代謝相關(guān)酶的合成。

3.2 高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)免疫力的影響

魚(yú)類(lèi)血液指標(biāo)能反映魚(yú)類(lèi)機(jī)體健康和生理狀態(tài)，RBC具有識(shí)別、黏附和殺傷抗原、清除免疫復(fù)合物和參與機(jī)體免疫調(diào)控的作用，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。鐵是RBC的重要組成成分，鐵的缺乏會(huì)引起機(jī)體RBC數(shù)量的下降，吞噬細(xì)胞活性受損，使免疫力下降等癥狀［19］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高棉籽粕飼料能使青魚(yú)血液RBC數(shù)量顯著下降，與 Blom 等［6］等對(duì)虹鱒和 Yildirim 等［20］對(duì)斑點(diǎn)叉尾 的研究結(jié)果相似，但在高棉籽粕飼料中補(bǔ)充鐵后青魚(yú)血液中RBC數(shù)量有所增加，與Rojas 等［21］、Wedegaertner［22］、Jones［23］和 Martin［24］的研究結(jié)果相同，高棉籽粕飼料降低血液RBC數(shù)量可能與棉籽粕中游離棉酚在腸道內(nèi)與鐵結(jié)合，降低鐵的吸收利用有關(guān)，補(bǔ)充鐵后可緩解由于游離棉酚結(jié)合鐵而引起RBC數(shù)量降低癥狀［25］。

C4和LZM是重要的非特異性免疫指標(biāo)，棉籽粕替代豆粕后使青魚(yú)血清LZM活力和C4含量顯著下降，與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果一致［11］，而在高棉籽粕飼料中同時(shí)補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵可顯著提高血清LZM活力和C4含量，可能與補(bǔ)充的鐵和賴(lài)氨酸與游離棉酚結(jié)合形成無(wú)毒的結(jié)合棉酚，降低了游離棉酚對(duì)機(jī)體的毒性作用有關(guān)。

GOT和GPT是反映肝功能的重要指標(biāo)，當(dāng)組織中毒、發(fā)生病變或者受損傷后，大量的GOT和GPT從細(xì)胞進(jìn)入血液中，使血清中這2種酶的活力升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，棉籽粕替代豆粕后使青魚(yú)血清GOT和GPT活力顯著升高，可能與高棉籽粕飼料中游離棉酚使肝功能受損有關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)前期研究結(jié)果一致［11］。同時(shí)，與高棉籽粕飼料組相比，高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵后顯著降低了青魚(yú)血清GOT和GPT活力，說(shuō)明高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵可以有效降低棉籽粕中游離棉酚的毒性，改善肝功能，與Braham等［25］等在小鼠(Mus musculus)上的研究結(jié)果相同。

3.3 高棉籽粕飼料中補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)組織中游離棉酚含量的影響

肝臟是游離棉酚累積的主要器官［14，26］。本研究結(jié)果表明，高棉籽粕飼料中補(bǔ)充鐵可使肌肉和肝臟中游離棉酚的含量顯著降低，與在尼羅羅非魚(yú)［9］、斑點(diǎn)叉尾［13］上得出的結(jié)果相似，可能與高棉籽粕飼料中補(bǔ)充的鐵和游離棉酚結(jié)合有關(guān)［15－16］。

此外，本試驗(yàn)結(jié)果還表明，棉籽粕替代豆粕后使魚(yú)體粗脂肪含量升高，粗蛋白質(zhì)含量下降，而補(bǔ)充鐵和賴(lài)氨酸后魚(yú)體粗脂肪含量下降，粗蛋白質(zhì)含量升高，這可能與高棉籽粕飼料中的游離棉酚降低飼料中鐵和賴(lài)氨酸的利用，從而影響了機(jī)體的脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。

4 結(jié)論

高棉籽粕飼料中同時(shí)補(bǔ)充賴(lài)氨酸和鐵能促進(jìn)青魚(yú)生長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫力，降低肌肉和肝臟中游離棉酚含量，降低對(duì)肝臟的損傷，可有效提高飼料中棉籽粕的使用量。

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