樊建勇 王穎 楊慧蘭 梁潔 李翠華

單純皰疹病毒2 gD基因的樹(shù)突細(xì)胞疫苗免疫效應(yīng)研究

樊建勇 王穎 楊慧蘭 梁潔 李翠華

目的觀察單純皰疹病毒2 gD(HSV-2 gD)基因的樹(shù)突細(xì)胞(DC)疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答情況。方法用腺病毒介導(dǎo)的、HSV-2 gD基因修飾的DC(pAdeno-HSV-2 gD-DC)疫苗免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第10天檢測(cè)小鼠血清中g(shù)D IgG水平;同時(shí),分離小鼠脾淋巴細(xì)胞,用HSV-2gD蛋白刺激,MTT法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況、乳酸脫氫酶釋放法測(cè)定細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性及ELISA法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中干擾素γ(IFN-γ)、白介素4(IL-4)水平。實(shí)驗(yàn)分為4組,pAdeno-DC組、pAdeno-HSV-2 gD-DC組、DC組、空白對(duì)照組,每組10只。結(jié)果pAdeno-HSV-2 gD-DC組小鼠血清內(nèi)可檢測(cè)到高滴度針對(duì)HSV-2gD蛋白的抗體(A450值為0.313±0.034),與pAdeno-DC組(0.034±0.009)、DC組(0.028±0.009)、空白對(duì)照組(0.026±0.010)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。pAdeno-HSV-2 gD-DC可以誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖(刺激指數(shù)為1.600±0.215)、有效殺傷靶細(xì)胞(CTL活性為37.1%),與pAdeno-DC組(分別為1.063±0.070和16.0%)、DC組(1.056±0.063和14.9%)、空白對(duì)照組(1.020±0.051和15.7%)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。pAdeno-HSV-2 gD-DC組小鼠分離的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清可以檢測(cè)到高水平IFN-γ(A450值為0.568±0.031) 和IL-4(A450值為0.544±0.043),與pAdeno-DC組(0.266±0.021和0.278±0.037)、DC組(0.271±0.023和0.275±0.044)、空白對(duì)照組(0.252±0.012和0.245±0.051)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論構(gòu)建的pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗可以在小鼠中產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答。

皰疹病毒2型,人;樹(shù)突細(xì)胞;單純皰疹病毒疫苗

單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)包括HSV-1和HSV-2兩型,HSV-2一般與外生殖器感染有關(guān)。在防治HSV-2感染的方法中,疫苗是免疫治療的重要手段。樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell,DC)疫苗由于能誘導(dǎo)出較好的細(xì)胞免疫和體液免疫而日益受到重視。合適的靶點(diǎn)是制備有效疫苗的關(guān)鍵,在HSV-2編碼的糖蛋白中,gD是產(chǎn)生中和抗體的主要糖蛋白,也是宿主細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的重要靶標(biāo)［1］。前期工作中,我們利用安全、高效、簡(jiǎn)便的腺病毒作為載體,將HSV-2-gD基因轉(zhuǎn)染DC,構(gòu)建了含HSV-2 gD基因的DC(pAdeno-HSV-2 gDDC)疫苗,本研究應(yīng)用我們構(gòu)建的pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗免疫小鼠,觀察其對(duì)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響。

材料與方法

一、材料

1.動(dòng)物:4～6周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠,購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［許可證編號(hào):SYXK(粵)2013-0092］。

2.主要試劑:HSV-2gD蛋白(美國(guó)Immune-Tech公司),羊抗小鼠HRP-IgG(武漢博士德公司),MTT(美國(guó)Sigma公司),干擾素 γ(IFN-γ)、白介素 4(IL-4)ELISA試劑盒(武漢博士德公司)。含HSV-2 gD基因的DC(pAdeno-HSV-2 gD-DC)疫苗由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

二、方法

1.免疫動(dòng)物:40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組:pAdeno-DC組、pAdeno-HSV-2 gD-DC組、DC組、空白對(duì)照組,每組10只。各組每只小鼠均于腹腔注射對(duì)應(yīng)DC 0.1 ml(105個(gè)),共免疫3次,每次間隔7 d。最后1次免疫后10 d,取小鼠血清及脾細(xì)胞測(cè)定免疫學(xué)指標(biāo)。

2.脾細(xì)胞懸液的制備:將小鼠斷椎處死后,取脾,分離單細(xì)胞懸液。然后分別用200目和400目不銹鋼絲網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液。用含10%小牛血清的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞至107/ml。

3.HSV-2 gD血清IgG抗體的檢測(cè):小鼠于免疫完成后10 d眼眶取血,ELISA法檢測(cè)血清IgG水平。HSV-2型gD蛋白為包被抗原,一抗為免疫小鼠血清,二抗為羊抗鼠HRP-IgG,顯色后酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm測(cè)A值。

4.脾細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4水平測(cè)定:用1640培養(yǎng)液重懸分離的脾淋巴細(xì)胞至5×106/ml,取100 μl加入96孔培養(yǎng)板,同時(shí)加入50 μl 1640配置的10 mg/L gD蛋白,培養(yǎng)72 h后,500×g離心5 min,取上清,用ELISA試劑盒檢測(cè)上清IFN-γ、IL-4水平。

5.MTT法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞增殖:用1640培養(yǎng)液重懸分離的脾淋巴細(xì)胞至5×106/ml,取100 μl加入96孔培養(yǎng)板,同時(shí)加入50 μl 1640配置的10 mg/L gD蛋白,培養(yǎng)72 h后,加入MTT 20 μl后37℃溫育4 h,去上清,加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)振蕩10 min,酶標(biāo)儀490 nm測(cè)A值。刺激指數(shù)(SI)=A實(shí)驗(yàn)孔/A對(duì)照孔。

6.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性測(cè)定:以骨髓瘤細(xì)胞SP20為靶細(xì)胞,用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測(cè)定［2-3］。 取 5 × 106/ml脾細(xì)胞懸液 1.5 ml于 24 孔板,加2 mg/L植物凝血素(PHA),37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后,再加20 mg/L IL-2和2 mg/L HSV-2 gD抗原培養(yǎng)5 d,收集未貼壁細(xì)胞,調(diào)整至106/ml。取生長(zhǎng)良好的SP20靶細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)前用gD抗原蛋白共育過(guò)夜,10%新生牛血清(NCS)-RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌并重懸至105/ml。實(shí)驗(yàn)設(shè)4組:靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、脾細(xì)胞自發(fā)釋放孔、實(shí)驗(yàn)孔(效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞)。脾效應(yīng)細(xì)胞為5×105/孔,效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞=50∶1,加樣于96孔板,總體積200 μl。300 ×g離心5 min,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)結(jié)束前1 h同上離心,小心吸取上清液0.1 ml,加LDH底物混合液0.1 ml,室溫下反應(yīng)30 min后加0.1 mol/L檸檬酸30 μl終止反應(yīng),置BIORAD550型酶標(biāo)儀測(cè)A490值。計(jì)算CTL活性,CTL細(xì)胞活性(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A490值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔A490值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔A490值)(/靶細(xì)胞最大釋放孔A490值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔A490值)×100。

結(jié) 果

見(jiàn)表1。pAdeno-HSV-2 gD-DC組BALB/c小鼠HSV-2 gD血清IgG抗體、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4水平、IFN-γ水平、小鼠脾細(xì)胞增殖刺激指數(shù)均高于pAdeno-DC組、DC組和空白對(duì)照組,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05);pAdeno-DC 組 、DC組、空白對(duì)照組間各檢測(cè)結(jié)果經(jīng)LSD法兩兩比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞為50∶1時(shí),pAdeno-HSV-2 gD-DC組小鼠脾臟CTL活性為37.1%,高于pAdeno-DC組(16.0%)、DC組(14.9%)和空白對(duì)照組(15.7%),經(jīng)方差分析(F值為70.14),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05);pAdeno-DC組、DC組、空白對(duì)照組間經(jīng)LSD法兩兩比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

討 論

HSV-2由30多種蛋白組成病毒結(jié)構(gòu)蛋白,在保護(hù)HSV的DNA以及HSV的致病作用和誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答中起重要作用。其中,被普遍認(rèn)為有免疫原性并能誘發(fā)保護(hù)性作用的是gD糖蛋白。gD蛋白在病毒復(fù)制和刺激中和抗體的產(chǎn)生中起重要作用,是疫苗治療的理想靶標(biāo)之一［4］。

DC是體內(nèi)最活躍、功能最強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞,是細(xì)胞特異免疫應(yīng)答的直接啟動(dòng)者和調(diào)控者。成熟的DC高表達(dá)MHC分子、協(xié)同刺激分子,并分泌多種趨化因子和細(xì)胞因子,通過(guò)抗原提呈,直接激活初始型T細(xì)胞,激活人體免疫功能［5-6］。目前DC疫苗的研究主要集中在抗腫瘤、病毒感染性疾病治療這兩個(gè)領(lǐng)域。傳統(tǒng)上的抗微生物病原體疫苗是通過(guò)分離病原體弱毒株或者滅活病原體,再輔以增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑來(lái)制備的。此類(lèi)疫苗的效果取決于其是否能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體。而對(duì)于一些胞內(nèi)病毒感染性疾病,這種方法卻不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)性抗體應(yīng)答,這類(lèi)疾病的控制主要依賴(lài)細(xì)胞免疫。DC疫苗能激發(fā)足夠強(qiáng)大的CTL反應(yīng),在抗病毒方面發(fā)揮巨大作用［7］。2002年,Chiriva-Internati等［8］用含 HPV16 GST-E7 基因的重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染DC,在轉(zhuǎn)染后的第7天就能誘發(fā)強(qiáng)烈的CTL反應(yīng),腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染的DC與T細(xì)胞共同培養(yǎng)后,T細(xì)胞分泌更多的IFN-γ。 Akbar等［9］研究表明,HBsAg負(fù)載的DC疫苗比單純蛋白疫苗誘導(dǎo)出數(shù)量更多的CTL。焦栓林等［10］構(gòu)建了能表達(dá)HBsAg的重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來(lái)源的DC制備疫苗,將此DC疫苗免疫乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠2次,結(jié)果表明,HBsAg重組腺病毒轉(zhuǎn)染的DC能在體內(nèi)有效地誘導(dǎo)Th1反應(yīng)和特異性CTL反應(yīng)。

表1 含單純皰疹病毒2 gD(HSV-2 gD)基因的樹(shù)突細(xì)胞(DC)疫苗誘發(fā)的BALB/c雌性小鼠特異性免疫應(yīng)答(±s)

表1 含單純皰疹病毒2 gD(HSV-2 gD)基因的樹(shù)突細(xì)胞(DC)疫苗誘發(fā)的BALB/c雌性小鼠特異性免疫應(yīng)答(±s)

注:n=3

組別 血清IgG抗體(A450值)脾細(xì)胞增殖刺激指數(shù)空白對(duì)照組 0.026±0.010 0.245±0.051 0.252±0.012 1.020±0.051 DC組 0.028±0.009 0.275±0.044 0.271±0.023 1.056±0.063 pAdeno-DC組 0.034±0.009 0.278±0.037 0.266±0.021 1.063±0.070 pAdeno-HSV-2 gD-DC組 0.313±0.034 0.544±0.043 0.568±0.031 1.600±0.215 F值 558.02 100.53 446.77 53.44 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05培養(yǎng)上清中IL-4(A450值)培養(yǎng)上清中IFN-γ(A450值)

理想的HSV疫苗應(yīng)該可以誘發(fā)消除性免疫,即在HSV侵入人類(lèi)機(jī)體的各種途徑如生殖道、口鼻黏膜等時(shí)都能夠誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答,并且對(duì)病毒的再感染具有抵抗力。Domingo等［11］構(gòu)建了gD和gB多表位復(fù)合疫苗,該疫苗免疫刺激機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)效果要優(yōu)于單一糖蛋白免疫的效果。徐金華等［12］將HSV-2糖蛋白gD、gB、gC和早期表達(dá)蛋白ICP27基因融合,構(gòu)建了HSV-2多表位復(fù)合疫苗,用其免疫小鼠,可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在本實(shí)驗(yàn)中,我們用pAdeno-DC、pAdeno-HSV-2 gD-DC、DC免疫小鼠后,pAdeno-HSV-2 gD-DC組可以刺激血清HSV-2gD蛋白抗體的產(chǎn)生,誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖及分泌IFN-γ、IL-4,誘發(fā)強(qiáng)烈的CTL反應(yīng),與pAdeno-DC組、DC組、空白對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子,主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,常作為粗略反映細(xì)胞免疫的指標(biāo)。本研究結(jié)果提示,我們構(gòu)建的pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗可以刺激小鼠產(chǎn)生有效的特異性免疫應(yīng)答,為其在臨床的應(yīng)用研究打下了基礎(chǔ)。

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An experimental study on the immune response induced by a dendritic cell-based vaccine carrying the herpes simplex virus type 2 glycoprotein D gene in mice

Fan Jianyong，Wang Ying，Yang Huilan，Liang Jie，Li Cuihua.Department of Dermatology，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，China

Fan Jianyong，Email:fanjianyong@hotmail.com

Objective To evaluate the specific immune response induced by a dendritic cell-based adenovirus-mediated vaccine carrying the herpes simplex virus type 2 glycoprotein D gene(pAdeno-HSV-2 gD-DC)in BALB/c mice.Methods Forty BALB/c mice were equally divided into four groups:blank control group receiving no treatment，pAdeno-DC group immunized with pAdeno-DC，pAdeno-HSV-2 gD-DC group immunized with the previously constructed vaccine pAdeno-HSV-2 gD-DC，DC group immunized with DCs only.Totally，three rounds of vaccination were conducted at a 7-day interval.Ten days after the last vaccination，serum samples were collected and spleen cells were isolated from these mice.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to measure the level of IgG antibody against HSV-2 gD in the serum samples.Some spleen cells were stimulated with HSV-2 gD protein(10 mg/L)for 72 hours；then，ELISA was carried out to determine the levels of interferon(IFN)-γ and interleukin(IL)-4 in the supernatant，and 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5 diphenyl tetrazolium bromide(MTT)assay to estimate the proliferative activity of these cells.The cytotoxicity of spleen cells was also evaluated based on the measurement of lactate dehydrogenase(LDH)release.Results The serum level of IgG antibody against HSV-2 gD(given in the absorbance value at 450 nm)was 0.313 ± 0.034 in the pAdeno-HSV-2 gD-DC group，significantly higher than that in the pAdeno-DC group，DC group and blank control group(0.034± 0.009，0.028± 0.009 and 0.026± 0.010 respectively，allP＜ 0.05).Increased proliferative activity and cytotoxicity were observed in spleen cells from the pAdeno-HSV-2 gD-DC group compared with those from the pAdeno-DC group，DC group and blank control group(cell stimulation index:1.600± 0.215 vs.1.063± 0.070，1.056± 0.063 and 1.020±0.051，allP＜ 0.05；percentage of cytotoxicity:37.1%vs.16.0%，14.9%and 15.7%，allP＜ 0.05).The levels of IFN-γ and IL-4(both given in the absorbance value at 450 nm)were 0.568±0.031 and 0.544±0.043 respectively in the supernatant of spleen cells from the pAdeno-HSV-2 gD-DC group，compared to 0.266±0.021 and 0.278±0.037 respectively in the pAdeno-DC group(bothP＜0.05)，0.271±0.023 and 0.275±0.044 respectively in the DC group(bothP＜0.05)，and 0.252±0.012 and 0.245±0.051 respectively in the blank control group(bothP＜0.05).Conclusion The vaccine pAdeno-HSV-2 gD-DC could induce a specific and strong immune response in BALB/c mice.

Herpesvirus 2，human；Dendritic cells；Herpes simplex virus vaccines

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.012

國(guó)家自然科學(xué)基金(81071401)

510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科

樊建勇,Email:fanjianyong@hotmail.com

2013-12-16)

(本文編輯:顏艷)