鄧 祥，黃小梅，吳 狄

（1.四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 達(dá)州635000；2.“特色植物開發(fā)研究”四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 達(dá)州635000）

0 引言

佛手（Bergamot）為蕓香科植物佛手的干燥果實(shí).又名佛手柑、佛手香櫞、密筒柑、福壽柑、密羅柑、五指柑等，[1]為枸櫞的變種.其味辛、苦、甘，性溫，入肝、脾、胃三經(jīng)，有理氣化痰、止嘔消脹、舒肝健脾、和止胃痛之功效，用于治療肝郁氣滯、脾胃氣滯、胸脅脹痛、食少嘔吐、胃脘痞滿等癥，[2-3]其主要化學(xué)成分為黃酮、揮發(fā)油和糖類物質(zhì).[4]大量研究表明：佛手具有降血糖、降血脂、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性，其有效成分除與其所含的多糖類物質(zhì)有關(guān)外，還可能與黃酮類化合物有關(guān).[5-8]因此，研究佛手中黃酮類物質(zhì)對(duì)于提高佛手的經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有十分重要的意義.[9]

目前，黃酮的提取方法主要有超臨界流體萃取、溶劑浸提、樹脂吸附分離、微波浸提和離子沉淀等方法.超聲波提取法作為一種高效節(jié)能的提取技術(shù)，是近年來中藥材提取研究的熱點(diǎn)，有著良好的應(yīng)用前景.本文采用超聲波提取方法，利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)川佛手中的總黃酮進(jìn)行了研究，確定了川佛手中總黃酮的最佳提取方法和工藝參數(shù)，為川佛手中總黃酮的提取提供技術(shù)參考.

1 儀器、試劑和樣品

1.1 主要儀器設(shè)備

BILON-2008型超聲波萃取儀（天津比朗實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；GT10-2型離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；TG328A型電子天平（上海精密儀器有限公司）；60目的篩子.

1.2 主要材料和試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海試劑）；川佛手（四川達(dá)州產(chǎn)）；氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉和無水乙醇等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

2 方法與實(shí)驗(yàn)

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[10-12]

準(zhǔn)確稱取20.0mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用適量體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶解完全，并在100mL的容量瓶中定容，作為儲(chǔ)備液.從儲(chǔ)備液中分別移取0 mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL 于 7個(gè)25mL容量瓶中，分別依次加入50%乙醇溶液至容量瓶的一半，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液1.0mL，混合均勻后放置5min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的 Al（NO3）3溶液1.0mL，均勻混合后放置5min，加入1mol·L-1的氫氧化鈉溶液5mL，混勻，最后用50%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置10min.以第1瓶作對(duì)照，在510nm最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1.

圖1 總黃酮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 精密度測(cè)定實(shí)驗(yàn)

精確稱取川佛手粉末0.5g，按2.2項(xiàng)方法操作，取不同時(shí)間點(diǎn)，重復(fù)測(cè)定5次，其吸光度分別為1.672，1.670，1.673，1.677，1.674，RSD 為0.15%.

2.1.3 重復(fù)性測(cè)定實(shí)驗(yàn)

精確稱取川佛手粉末5份，各0.5g，按2.2項(xiàng)方法操作，其吸光度分別為1.642，1.635，1.647，1.629，1.622，RSD為0.61%.

2.1.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精確稱取已知含量的川佛手粉末5份，各0.5g，加入不同量的蘆丁對(duì)照品，按2.2項(xiàng)方法操作測(cè)定加樣回收率，依法重復(fù)測(cè)定3次，平均回收率為97.92%，RSD為1.36%.

2.2 樣品中總黃酮的提取及測(cè)定

將干燥好的川佛手片用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，備用.精確稱取0.5g川佛手粉末于離心管中，加入適量體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，用超聲波萃取儀進(jìn)行超聲提取后，離心，將上層清液收集于25mL容量瓶中，重復(fù)提取2～3次，用50%乙醇定容，再準(zhǔn)確移取定容后的提取液5mL于25mL容量瓶中，按2.1.1的方法處理，測(cè)定吸光度，得到提取液濃度，按下式計(jì)算其提取效率[13].

其中：C—提取液中的總黃酮濃度（g·L-1）

V—提取液的體積（L）

M—川佛手的質(zhì)量（g）

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇

在10mL溶液、超聲溫度50℃和超聲功率1000W的條件下超聲1.0h，分別討論乙醇體積分?jǐn)?shù)為30、40、50、60、70、80%的情況下對(duì)總黃酮提取率的影響，如圖2所示.

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇

由圖可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%之前，總黃酮的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而呈現(xiàn)緩和的下降趨勢(shì).根據(jù)相似相容原理，這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，醇溶性物質(zhì)大量溶出，相互競(jìng)爭(zhēng)，反而限制了某些黃酮類物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致了總黃酮的溶解度降低.因此最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，最大提取率為2.25%.

3.1.2 料液比選擇

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、超聲溫度50℃和超聲功率1000W條件下超聲1.0h，分別討論在料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22g·mL-1情況下對(duì)黃酮提取率的影響，如圖3所示.

圖3 液料比選擇

料液比較小時(shí)，總黃酮提取率較低；隨著料液比的不斷增大，總黃酮的提取越來越充分，提取率不斷增加，但料液比過大，其它組分溶解形成相互競(jìng)爭(zhēng)反而不利于總黃酮的浸出.從圖3可知當(dāng)料液比為1：18（g·mL-1）時(shí)提取效果最好，總黃酮最大提取率為2.75%.

3.1.3 超聲溫度選擇

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶18g·mL-1和超聲功率1000W的條件下超聲1.0h，分別討論在超聲溫度為25、35、45、55、65、75℃情況下對(duì)黃酮提取率的影響，如圖4所示.

圖4 超聲溫度選擇

從圖中可以看出，溫度在45℃之前，總黃酮的提取率隨著溫度的升高而增大，之后隨著溫度的升高而減小.究其原因是：超聲溫度過低，總黃酮不易浸出，提取率較低；溫度較高，分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，有利于總黃酮的浸出，提取率較高；溫度過高，黃酮不穩(wěn)定，導(dǎo)致黃酮部分分解，提取率反而降低.因此最佳的超聲溫度為45℃，提取率最大值為3.00%.

3.1.4 超聲時(shí)間選擇

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶18g·mL-1、超聲溫度45℃和超聲功率1000W的條件下，分別討論在提取時(shí)間為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h情況下對(duì)總黃酮提取率的影響，如圖5所示.

圖5 超聲時(shí)間選擇

由上圖可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮的提取率不斷增大，1.5h時(shí)達(dá)最大值，之后，增加趨勢(shì)變緩，甚至略有下降.這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間太長(zhǎng)，被提取出來的其它組分抑制部分黃酮的浸出，導(dǎo)致總黃酮提取率降低.所以最佳超聲時(shí)間選1.5h，提取率最大值為3.75%.

3.1.5 超聲功率選擇

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶18g·mL-1、超聲溫度45℃條件下超聲1.5h，分別討論在提取功率為：300、500、700、900、1100、1300W情況下對(duì)總黃酮提取率的影響，如圖6所示.

由上圖可知，總黃酮的提取率隨著超聲功率的增加而不斷增加，當(dāng)超聲功率超過900W時(shí)，總黃酮的提取率趨于穩(wěn)定.因此選取900W為最佳超聲功率，其最大提取率為3.78%.

3.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定900W超聲功率不變，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）和超聲時(shí)間（D）四個(gè)因素進(jìn)行 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，考察川佛手中總黃酮的提取率.其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和表2所示.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

由以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和極差R1＞R2＞R3＞R4分析可知：川佛手總黃酮提取工藝中，各因素影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、料液比，其次是超聲時(shí)間，可見，影響總黃酮提取率的主要因素是乙醇的體積分?jǐn)?shù).通過正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取工藝為A2B2C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲溫度為45℃，料液比為1：20（g·mL-1），超聲時(shí)間為1.0h，總黃酮的提取率為4.160%.

4 結(jié)論

溶液為溶劑，采用在超聲波條件下進(jìn)行浸提，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、料液比、超聲時(shí)間和超聲功率等因素對(duì)總黃酮提取率的影響，并采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了川佛手中總黃酮的最佳提取方法和工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲溫度為45℃，料液比為1：20（g·mL-1），超聲時(shí)間為1.0h，超聲功率為900 W，總黃酮的提取率可達(dá)4.16%.

本文以川產(chǎn)道地中藥材佛手為原料和乙醇水

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：上[M].上海：上海人民出版社，1986：1141.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：第1部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：124.

[3]姜立春，黃成思，楊 澈，等.川佛手總黃酮提取及抗氧化性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（3）：340-342.

[4]袁旭江，林 勵(lì).中藥佛手不同品種間的研究及其存在問題[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2002（1）：73-76.

[5]O.Benavente-Garcia，J.Castillo.Update on Uses and Propertise of Citrus Flavonoids：New Findings in Anticancer，Cardiovascular，and Anti-inflammatory Activity[J].Journal of Agricultural and Food chemistry，2008（56）：6185-6205.

[6]Mandalari G，Bennett R N，Bisignano G，et al.Antimicrobial activity of flavonoids extracted from Bergamot（Citrus bergamia Risso）peel，a byproduct of the essential oil industry[J].Journal of Applied Microbiology，2007（6）：2056-2064.

[7]Giuseppina Mandalari，Richard N.Bennett，Andrew R.Kirby，et al.Enzymatic hydrolysis of Flavonoids and Pectic Oligosaccharides from Bergamot（Citrus bergamia Risso）peel[J].Journal of Agricultural and Food chemistry，2006（54）：8307-8313.

[8]章 斌，侯小楨，饒 強(qiáng).響應(yīng)面優(yōu)化佛手總黃酮超聲提取及抗氧化研究[J].食品研究與開發(fā)，2012（2）：27-31.

[9]章 斌，侯小楨.復(fù)合酶法提取廣佛手總黃酮的工藝[J].食品研究與開發(fā)，2010（10）：188-191.

[10]劉增根，黨 軍，江 磊，等.柴達(dá)木枸杞葉有效成分高壓均質(zhì)提取及純化[J].精細(xì)化工，2011（4）：350-354.

[11]李攀登，李金玲，王宏偉，等.雞樹條莢蒾化學(xué)成分測(cè)定分析[J].人參研究，2009（2）：16-19.

[12]羅偉強(qiáng).四種提取柑皮中黃酮化合物的方法比較[J].甘肅化工，2003（1）：25-26.