鄧 祥，黃小梅，吳 狄

（1.四川文理學院 化學化工學院，四川 達州635000；2.“特色植物開發(fā)研究”四川省高校重點實驗室，四川 達州635000）

0 引言

佛手（Bergamot）為蕓香科植物佛手的干燥果實.又名佛手柑、佛手香櫞、密筒柑、福壽柑、密羅柑、五指柑等，[1]為枸櫞的變種.其味辛、苦、甘，性溫，入肝、脾、胃三經(jīng)，有理氣化痰、止嘔消脹、舒肝健脾、和止胃痛之功效，用于治療肝郁氣滯、脾胃氣滯、胸脅脹痛、食少嘔吐、胃脘痞滿等癥，[2-3]其主要化學成分為黃酮、揮發(fā)油和糖類物質.[4]大量研究表明：佛手具有降血糖、降血脂、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性，其有效成分除與其所含的多糖類物質有關外，還可能與黃酮類化合物有關.[5-8]因此，研究佛手中黃酮類物質對于提高佛手的經(jīng)濟價值具有十分重要的意義.[9]

目前，黃酮的提取方法主要有超臨界流體萃取、溶劑浸提、樹脂吸附分離、微波浸提和離子沉淀等方法.超聲波提取法作為一種高效節(jié)能的提取技術，是近年來中藥材提取研究的熱點，有著良好的應用前景.本文采用超聲波提取方法，利用單因素實驗和正交實驗對川佛手中的總黃酮進行了研究，確定了川佛手中總黃酮的最佳提取方法和工藝參數(shù)，為川佛手中總黃酮的提取提供技術參考.

1 儀器、試劑和樣品

1.1 主要儀器設備

BILON-2008型超聲波萃取儀（天津比朗實驗儀器制造有限公司）；UV-2550型紫外可見分光光度計（日本島津）；GT10-2型離心機（北京時代北利離心機有限公司）；TG328A型電子天平（上海精密儀器有限公司）；60目的篩子.

1.2 主要材料和試劑

蘆丁標準品（上海試劑）；川佛手（四川達州產(chǎn)）；氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉和無水乙醇等均為分析純；實驗用水均為二次蒸餾水.

2 方法與實驗

2.1 方法學考察

2.1.1 標準曲線的繪制[10-12]

準確稱取20.0mg蘆丁標準品，用適量體積分數(shù)為50%的乙醇溶解完全，并在100mL的容量瓶中定容，作為儲備液.從儲備液中分別移取0 mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL 于 7個25mL容量瓶中，分別依次加入50%乙醇溶液至容量瓶的一半，加入質量分數(shù)為5%的NaNO2溶液1.0mL，混合均勻后放置5min，加入質量分數(shù)為10%的 Al（NO3）3溶液1.0mL，均勻混合后放置5min，加入1mol·L-1的氫氧化鈉溶液5mL，混勻，最后用50%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置10min.以第1瓶作對照，在510nm最大吸收波長處測定吸光度，繪制標準曲線，如圖1.

圖1 總黃酮含量測定標準曲線

2.1.2 精密度測定實驗

精確稱取川佛手粉末0.5g，按2.2項方法操作，取不同時間點，重復測定5次，其吸光度分別為1.672，1.670，1.673，1.677，1.674，RSD 為0.15%.

2.1.3 重復性測定實驗

精確稱取川佛手粉末5份，各0.5g，按2.2項方法操作，其吸光度分別為1.642，1.635，1.647，1.629，1.622，RSD為0.61%.

2.1.4 加樣回收率實驗

精確稱取已知含量的川佛手粉末5份，各0.5g，加入不同量的蘆丁對照品，按2.2項方法操作測定加樣回收率，依法重復測定3次，平均回收率為97.92%，RSD為1.36%.

2.2 樣品中總黃酮的提取及測定

將干燥好的川佛手片用粉碎機粉碎，過60目篩，備用.精確稱取0.5g川佛手粉末于離心管中，加入適量體積分數(shù)為50%的乙醇，用超聲波萃取儀進行超聲提取后，離心，將上層清液收集于25mL容量瓶中，重復提取2～3次，用50%乙醇定容，再準確移取定容后的提取液5mL于25mL容量瓶中，按2.1.1的方法處理，測定吸光度，得到提取液濃度，按下式計算其提取效率[13].

其中：C—提取液中的總黃酮濃度（g·L-1）

V—提取液的體積（L）

M—川佛手的質量（g）

3 結果與討論

3.1 單因素實驗

3.1.1 乙醇體積分數(shù)選擇

在10mL溶液、超聲溫度50℃和超聲功率1000W的條件下超聲1.0h，分別討論乙醇體積分數(shù)為30、40、50、60、70、80%的情況下對總黃酮提取率的影響，如圖2所示.

圖2 乙醇體積分數(shù)選擇

由圖可知，乙醇體積分數(shù)在60%之前，總黃酮的提取率隨乙醇體積分數(shù)的增大而呈現(xiàn)上升趨勢，之后隨著乙醇體積分數(shù)的增大而呈現(xiàn)緩和的下降趨勢.根據(jù)相似相容原理，這可能是由于乙醇體積分數(shù)增大，醇溶性物質大量溶出，相互競爭，反而限制了某些黃酮類物質的溶出，導致了總黃酮的溶解度降低.因此最佳的乙醇體積分數(shù)為60%，最大提取率為2.25%.

3.1.2 料液比選擇

在乙醇體積分數(shù)為60%、超聲溫度50℃和超聲功率1000W條件下超聲1.0h，分別討論在料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22g·mL-1情況下對黃酮提取率的影響，如圖3所示.

圖3 液料比選擇

料液比較小時，總黃酮提取率較低；隨著料液比的不斷增大，總黃酮的提取越來越充分，提取率不斷增加，但料液比過大，其它組分溶解形成相互競爭反而不利于總黃酮的浸出.從圖3可知當料液比為1：18（g·mL-1）時提取效果最好，總黃酮最大提取率為2.75%.

3.1.3 超聲溫度選擇

在乙醇體積分數(shù)為60%、料液比為1∶18g·mL-1和超聲功率1000W的條件下超聲1.0h，分別討論在超聲溫度為25、35、45、55、65、75℃情況下對黃酮提取率的影響，如圖4所示.

圖4 超聲溫度選擇

從圖中可以看出，溫度在45℃之前，總黃酮的提取率隨著溫度的升高而增大，之后隨著溫度的升高而減小.究其原因是：超聲溫度過低，總黃酮不易浸出，提取率較低；溫度較高，分子的熱運動加劇，有利于總黃酮的浸出，提取率較高；溫度過高，黃酮不穩(wěn)定，導致黃酮部分分解，提取率反而降低.因此最佳的超聲溫度為45℃，提取率最大值為3.00%.

3.1.4 超聲時間選擇

在乙醇體積分數(shù)為60%、料液比為1∶18g·mL-1、超聲溫度45℃和超聲功率1000W的條件下，分別討論在提取時間為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h情況下對總黃酮提取率的影響，如圖5所示.

圖5 超聲時間選擇

由上圖可知，隨著超聲時間的延長，總黃酮的提取率不斷增大，1.5h時達最大值，之后，增加趨勢變緩，甚至略有下降.這可能是因為超聲時間太長，被提取出來的其它組分抑制部分黃酮的浸出，導致總黃酮提取率降低.所以最佳超聲時間選1.5h，提取率最大值為3.75%.

3.1.5 超聲功率選擇

在乙醇體積分數(shù)為60%、料液比為1∶18g·mL-1、超聲溫度45℃條件下超聲1.5h，分別討論在提取功率為：300、500、700、900、1100、1300W情況下對總黃酮提取率的影響，如圖6所示.

由上圖可知，總黃酮的提取率隨著超聲功率的增加而不斷增加，當超聲功率超過900W時，總黃酮的提取率趨于穩(wěn)定.因此選取900W為最佳超聲功率，其最大提取率為3.78%.

3.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結果，固定900W超聲功率不變，對乙醇體積分數(shù)（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）和超聲時間（D）四個因素進行 L9（34）正交實驗，考察川佛手中總黃酮的提取率.其實驗結果如表1和表2所示.

表1 正交實驗因素水平表

表2 L9（34）正交實驗結果表

由以上實驗數(shù)據(jù)和極差R1＞R2＞R3＞R4分析可知：川佛手總黃酮提取工藝中，各因素影響的主次順序為A＞B＞C＞D，即乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、料液比，其次是超聲時間，可見，影響總黃酮提取率的主要因素是乙醇的體積分數(shù).通過正交實驗得到的最佳提取工藝為A2B2C3D1，即乙醇體積分數(shù)為60%，超聲溫度為45℃，料液比為1：20（g·mL-1），超聲時間為1.0h，總黃酮的提取率為4.160%.

4 結論

溶液為溶劑，采用在超聲波條件下進行浸提，研究了乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、料液比、超聲時間和超聲功率等因素對總黃酮提取率的影響，并采用正交實驗對提取工藝進行優(yōu)化，確定了川佛手中總黃酮的最佳提取方法和工藝參數(shù)：乙醇體積分數(shù)為60%，超聲溫度為45℃，料液比為1：20（g·mL-1），超聲時間為1.0h，超聲功率為900 W，總黃酮的提取率可達4.16%.

本文以川產(chǎn)道地中藥材佛手為原料和乙醇水

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