張曉瑜 李波 焦麗麗

(長春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)人參研究院 吉林長春 130117)

人參是五加科植物人參(Panax ginseng C.A.Meyer)的干燥根,自古以來被認(rèn)為是醫(yī)食同補的尚佳藥用植物,具有大補元氣,固脫生津,安神的作用。人參含有多種藥效成分,已被證明的藥物活性成分有皂甙、多糖、多肽、黃酮、揮發(fā)油等[1]。另外有大量研究表明人參水提物具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性,能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖及T淋巴細(xì)胞活性[2]。人參水提物中除含有多糖、皂苷、蛋白質(zhì)外,還有一定量的人參寡糖。

寡糖一般是指由2-10個單糖分子通過糖苷鍵連接而成的化合物,在生命體內(nèi),主要以糖蛋白、糖脂和糖肽等形式參與生命活動的,在發(fā)揮生物學(xué)功能的過程中起決定作用。隨著對天然寡糖研究的日益深入,它的獨特性也逐漸展現(xiàn)在人們面前。天然寡糖不僅具有抗炎癥、抗凝血、增強造血功能、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等生物活性,而且安全無毒[3-7]。迄今,對于人參寡糖的研究鮮少有報道,尤其是人參寡糖在免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤方面的作用及實驗研究尚未見報道。因此,我們從人參中提取了人參寡糖,并對其抗腫瘤作用及免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)人參寡糖對淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均可產(chǎn)生一定的影響,本文僅針對人參寡糖對巨噬細(xì)胞的激活作用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 樣品、試劑及儀器

5年生人參(Panax ginseng C.A.Meyer)購進(jìn)于吉林省白山市撫松縣;1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;新生牛血清為杭州四季青產(chǎn)品;脂多糖(LPS);二甲基亞砜(DMSO)、3-4,5-二甲基噻唑-2-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)均為Sigma公司產(chǎn)品;Griess試劑盒和iNOS測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;活性氧檢測試劑盒購買于碧云天生物技術(shù)研究所;ICR雄性小鼠(20.0±2.0g)購買于吉林大學(xué);其余藥品均為國產(chǎn)分析純。

二氧化碳培養(yǎng)箱,日本三洋電子公司;離心機,Sigma公司;酶標(biāo)儀瑞士TECAN公司。

1.2 CGOS提取方法

前期試驗運用正交試驗法確定人參寡糖粗提物的最佳提取條件為:料液比1:10,提取溫度70°C,提取次數(shù)3次,提取時間90min。方法:精確稱取人參粉末10g,加蒸餾水100ml,70°C提取90min,冷卻至室溫,離心,上清液儲存于(4℃),殘渣重復(fù)上述操作,合并上清液,旋蒸至50ml,凍干,即得粗寡糖。

1.3 CGOS對巨噬細(xì)胞的激活作用

1.3.1 巨噬細(xì)胞制備

用4%可溶性淀粉(2ml)連續(xù)腹腔注射ICR雄鼠3天,第4天將小鼠脫頸處死并用75%的乙醇浸泡10-15min,用預(yù)溫的1640無血清培養(yǎng)基(10ml)清洗小鼠腹腔,反復(fù)吹打,收集腹腔液,離心(1500r/min,5min),棄上清后用RPMI-1640培養(yǎng)基重新懸浮巨噬細(xì)胞。將細(xì)胞調(diào)至5×106/ml加至96孔板中,每孔100μl,置37℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h,用37℃預(yù)溫的PBS(0.01M,pH 7.4)清洗培養(yǎng)板2-3次,去除未貼壁細(xì)胞,即為純化的巨噬細(xì)胞。

1.3.2 巨噬細(xì)胞吞噬活性檢測

巨噬細(xì)胞吞噬中性紅:按“1.3.1”的方法將巨噬細(xì)胞純化,將CGOS 1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml,分別加入96孔板中(100μl/孔),分別繼續(xù)培養(yǎng)24h,棄去上清,加入質(zhì)量濃度為0.075% 中性紅溶液(100μl/孔),繼續(xù)培養(yǎng)1h,棄上清,用PBS(0.01M,pH 7.4)清洗96孔板2～3遍,加細(xì)胞裂解液(乙醇:乙酸=1:1,v/v)100μl孵育24h。用酶標(biāo)儀檢測,波長為540nm,LPS(20 μg／ml)為陽性對照,每組重復(fù)5個復(fù)孔。

1.3.3 巨噬細(xì)胞中NO含量檢測

由于NO在細(xì)胞外不穩(wěn)定,直接檢測很難,現(xiàn)有的檢測方法是使用Griess試劑檢測培養(yǎng)基上清中亞硝酸鹽的濃度,以間接地反應(yīng)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO的水平。此方法使用NaNO2作標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按照上述方法制備巨噬細(xì)胞,加入待測樣品(1-200μg/ml),LPS(20μg/ml)為陽性對照,分別培養(yǎng)24h,用Griess試劑盒檢測上清中NO2-的含量,并根據(jù)所繪制的NaNO2溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NO的產(chǎn)量。

1.3.4 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的檢測

純化后的巨噬細(xì)胞用不同濃度的待測樣品刺激,取細(xì)胞培養(yǎng)基上清100μl,通過比色法測iNOS的酶活力,按照試劑盒說明進(jìn)行操作,每個濃度5個復(fù)孔,并根據(jù)公式計算酶活力。

一個酶活力單位定義:=(iNOS檢測管OD值-iNOS空白管OD值/呈色物納摩爾消光系數(shù))×(反應(yīng)液總體積/取樣量)×(1/比色光徑×反應(yīng)時間)÷1000

1.3.5 TNF-α的誘生和檢測

圖1 CGOS 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的影響Fig 1 Effect of the oilgosaccharide CGOS on phagocytosis of macrophages

圖2 CGOS對小鼠巨噬細(xì)胞分泌NO產(chǎn)量的影響Fig 2 Effect of the oilgosaccharide CGOS on NO secretion of macrophages

圖3 CGOS對iNOS酶活力的影響Fig 3 Effect of CGOS on iNOS activity

圖4 CGOS對巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響Fig.4 Effect of CGOS on TNF-α production secreted by macrophages

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備按照上述同樣方式進(jìn)行制備,用1-200μg/ml的人參寡糖粗提37℃培養(yǎng)24h,收集上清用于TNF-α的活性的測定。培養(yǎng)液上清中的TNF-α按照Ferrari等人報道的方法進(jìn)行測定,靶細(xì)胞為L929細(xì)胞,以其對L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性表示TNF-α的活性。

2 結(jié)果

2.1 CGOS對巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的影響

為了觀察人參寡糖CGOS體外對腹腔巨噬細(xì)胞的激活作用,首先檢測了CGOS對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。結(jié)果如圖1所示,CGOS在10-100μg/ml能夠增強巨噬細(xì)胞的吞噬功能(P<0.01),并且,該作用呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系,當(dāng)作用濃度為50μg/mL時作用最明顯。

2.2 巨噬細(xì)胞中NO含量與iNOS活性檢測

如圖2,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)CGOS刺激后,NO的產(chǎn)量明顯增加,并且在10-100μg/ml范圍內(nèi),隨著作用濃度的增加,巨噬細(xì)胞分泌NO的產(chǎn)量也逐漸增加,當(dāng)作用濃度為100μg/ml時,NO的分泌水平最高。

上述結(jié)果表明CGOS與巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞分泌NO的能力增強,為了檢測NO產(chǎn)量的增加是否與iNOS的增量調(diào)節(jié)有關(guān),我們檢測了CGOS刺激后,iNOS酶活力的變化。結(jié)果表明,CGOS刺激后,巨噬細(xì)胞的iNOS的酶活力也相應(yīng)增加(圖3),并且當(dāng)濃度為100μg/ml時,iNOS酶活力最強。由此可見,CGOS作用后,巨噬細(xì)胞中iNOS的酶活力增強,從而導(dǎo)致NO產(chǎn)量的增加。

2.3 TNF-α的誘生和檢測

為了進(jìn)一步檢測CGOS對巨噬細(xì)胞的激活作用,我們也檢測了CGOS刺激后,巨噬細(xì)胞分泌TNF-α水平的變化。結(jié)果如圖4所示,用CGOS(1-200μg/ml)作用的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液上清處理L929細(xì)胞后,其細(xì)胞活力明顯下降,最高抑制率達(dá)40.45%。該結(jié)果表明CGOS能刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α,從而導(dǎo)致其殺傷L929細(xì)胞。

3 討論

巨噬細(xì)胞對于保持機體自身穩(wěn)定是必不可少的,并且在宿主防御系統(tǒng)中占據(jù)首要及中樞地位。首先,巨噬細(xì)胞通過非特異性吞噬作用殺傷微生物感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。除此以外,巨噬細(xì)胞還可以起到呈遞抗原的作用,或釋放一些細(xì)胞毒性因子(IL-1,TNF-α等)、活性氧(ROS)如O-2,H2O2及NO而顯示直接的細(xì)胞毒性。其中,NO是殺傷腫瘤細(xì)胞和病原微生物的主要物質(zhì)。在免疫系統(tǒng)中,由巨噬細(xì)胞合成的大量NO具有細(xì)胞毒作用,可殺傷微生物(包括細(xì)菌、病毒、真菌)、寄生蟲和腫瘤細(xì)胞等[13-14]。一氧化氮合酶(NOS)是NO合成過程中的關(guān)鍵酶。目前已知NOS有3種異構(gòu)體:神經(jīng)型(nNOS),內(nèi)皮型(eNOS),及誘生型(iNOS)。其中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)主要產(chǎn)生于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞自然殺傷細(xì)胞中。iNOS在靜息狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞中不表達(dá),但當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活時,iNOS可以大量表達(dá),誘發(fā)機體產(chǎn)生大量的NO[6]。因此在本試驗中選擇了以上幾個指標(biāo)來檢測人參寡糖粗提物對巨噬細(xì)胞的激活作用。

本實驗采用熱水低溫提取的方法,從人參中提取了人參寡糖粗提物CGOS,首先檢測了CGOS對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響,結(jié)果CGOS在1μg/ml-200μg/ml范圍內(nèi)能明顯增強小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力;其分泌TNF-α和NO的水平也顯著提高;本實驗同時還證明CGOS通過增強iNOS的酶活力,從而誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞分泌大量NO。表明人參寡糖CGOS對巨噬細(xì)胞有明顯的激活作用,這有可能是人參增強機體免疫力的作用方式之一。也將為人參的深加工提供又一科學(xué)依據(jù)。然而,人參寡糖激活巨噬細(xì)胞的作用機制仍不清楚。寡糖的單糖組成、連接鍵型、聚合度等都會影響其生物活性,因此,人參寡糖激活巨噬細(xì)胞的作用機理還有待于進(jìn)一步研究。

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