唐奕詩(shī) 馬楚瑩 周玉萍 陳瓊?cè)A 田長(zhǎng)恩

(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東廣州 510006)

2012年中國(guó)科學(xué)家利用最新的高通量測(cè)序技術(shù)和光學(xué)圖譜技術(shù),自主完成了染色體水平靈芝基因組精細(xì)圖譜,首次實(shí)現(xiàn)了中藥研究在基因組尺度尋找新的代謝功能基因及調(diào)控元件,為代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)及靈芝種質(zhì)保護(hù)與創(chuàng)新奠定了基礎(chǔ),推動(dòng)靈芝成為第一個(gè)“模式藥用真菌”[1-2]。近年靈芝遺傳轉(zhuǎn)化體系已逐步建立[3-4],今后可以通過代謝工程來(lái)改造或研究細(xì)胞代謝途徑的關(guān)鍵酶,從而提高靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)量[5],或以靈芝菌絲作為外源基因的表達(dá)系統(tǒng),使用轉(zhuǎn)基因靈芝發(fā)酵生產(chǎn)珍貴稀有的藥物蛋白等等,這些研究必將需要確定靈芝菌絲細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的定量變化。

圖1 靈芝菌絲體的制備

圖2 不同方法制備的蛋白質(zhì)樣品SDS-PAGE電泳圖譜

蛋白質(zhì)組學(xué)研究通過對(duì)生物體內(nèi)表達(dá)的各種蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別和定量分析,確定它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)外的定位、修飾、相互作用和功能,以期獲得對(duì)生命本質(zhì)和活動(dòng)規(guī)律的全景式認(rèn)識(shí)[6]。蛋白質(zhì)的提取是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首要步驟,其質(zhì)量的好壞直接影響蛋白質(zhì)表達(dá)分析研究的開展及其結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,在靈芝蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,獲取相關(guān)胞內(nèi)蛋白質(zhì),并保持其完整性是研究的首要問題。目前僅有靈芝子實(shí)體原基和破壁孢子粉中提取蛋白質(zhì)方法的報(bào)道[7-8]。本文以韋伯靈芝發(fā)酵菌絲為研究對(duì)象,在前人工作的基礎(chǔ)上選用了超聲波法、液氮冷凍研磨法和超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法來(lái)破碎細(xì)胞壁,采用高濃度尿素-硫脲溶解胞內(nèi)蛋白質(zhì)的方法提取菌絲總蛋白,并分析不同蛋白酶抑制劑對(duì)胞內(nèi)蛋白酶的抑制作用。本研究旨在建立一種高效靈芝菌絲體總蛋白的提取方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

韋伯靈芝(Ganoderma weberianum)采自廣州花都芙蓉彰,由本研究組分離純化得韋伯靈芝菌株TZC-1[9-10]。

綜合PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、VB12mg/L、瓊脂15g/L,pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基:綜合PDA培養(yǎng)基中去掉瓊脂,加入酵母膏5g/L,pH=4.8。

1.1.2 主要生化試劑

尿素、硫脲、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑混合物、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris堿等均購(gòu)自生工生物工程（上海)股份有限公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Fermentas。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲體制備

韋伯靈芝菌絲經(jīng)斜面活化后,轉(zhuǎn)接到綜合PDA平板上,26℃培養(yǎng)5d,用無(wú)菌打孔器將平板菌種制成直徑10mm,厚2mm的菌種塞,將菌種塞接種到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的300mL錐形瓶中,每瓶接入3個(gè)菌塞,在26℃、160r/min條件下恒溫震蕩5d,用蒸餾水反復(fù)清洗菌絲球5次,最后用濾紙反復(fù)吸干菌絲體水份,獲得新鮮菌絲球。

表1 含不同蛋白酶抑制劑提取的樣品中蛋白質(zhì)濃度

圖3 蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白樣品的影響

1.2.2 蛋白質(zhì)提取方法

參考胡斌斌發(fā)表的真菌總蛋白質(zhì)提取方法[11],但有所改進(jìn),詳細(xì)步驟為:

方法1:向預(yù)冷的研缽中加入適量的菌絲體,研缽置于冰上,將菌絲體研磨成粉末;稱取100mg菌絲粉末,加入750μL裂解液(8mol/L尿素,2.5mol/L硫脲,1.5mmol/LEDTA,10mmol/LTris,20mmol/LPMSF)懸浮起菌絲粉末;4℃冰浴30min,期間每隔5min混勻一次;用超聲波細(xì)胞破碎儀在冰浴中破碎菌體(750W,超聲6s,間隔1s,超聲20次);4℃12000r/min離心10min,棄沉淀保留上清液。

方法2:向裝有液氮的研缽中加入適量的菌絲體,研缽置于冰上,在液氮中將菌絲體研磨成粉末,接著按方法Ⅰ完成。

方法3:向裝有液氮的研缽中加入適量的菌絲體,研缽置于冰上,在液氮中將菌絲體研磨成粉末;加入750μL提取液Ⅰ(8mol/L尿素,2.5mol/L硫脲,1.5mmol/LEDTA,10mmol/LTris,20mmol/LPMSF或不同濃度的蛋白酶抑制劑混合物)。4℃冰浴60min;加250 μL提取液Ⅱ(4%CHAPS,4%DTT,0.5%SDS),渦旋30s×6次,間隔1min置于冰上;4℃10000r/min離心10min,棄沉淀保留上清液。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度按Bradford法[12]測(cè)定:根據(jù)測(cè)定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)在595nm處的吸光值(A),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,BSA濃度為橫座標(biāo),A595值為縱座標(biāo),其方程為:Y=0.894X+0.0164,R2=0.9968。樣品中的蛋白質(zhì)濃度根據(jù)樣品的吸光值、稀釋倍數(shù)和菌絲體重量算出,其單位為mg/g菌絲。

1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳

采用等體積上樣的方法,取提取的蛋白質(zhì)溶液15μL加3.7μL上樣緩沖液,混勻后取12μl進(jìn)行上樣,電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體的制備

靈芝菌絲經(jīng)發(fā)酵后,收集的菌絲球用蒸餾水反復(fù)洗滌可防止培養(yǎng)基中蛋白組分的污染;洗滌過的菌絲體含大量水分,需要用濾紙吸干,有利于在液氮中研磨成粉末。制備菌絲體時(shí),需要控制好時(shí)間,菌絲樣品正常呈淡黃色(圖1A),如果菌絲干燥后暴露在空氣中時(shí)間過長(zhǎng),菌絲將會(huì)變成褐色(圖1B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在相同提取條件下,以褐色菌絲體為材料提取的蛋白質(zhì)濃度明顯低于淡黃色菌絲體。

2.2 不同方法提取蛋白質(zhì)的比較

實(shí)驗(yàn)通過超聲波、超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨和液氮冷凍研磨等三種方法破碎靈芝菌絲細(xì)胞壁,采用高濃度尿素-硫脲法來(lái)溶解細(xì)胞蛋白質(zhì)組,所制備蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳和按Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,根據(jù)電泳圖譜及蛋白質(zhì)濃度來(lái)評(píng)估不同方法的效果。

從電泳圖譜(圖2)分析,超聲波法所得到的樣品中蛋白質(zhì)數(shù)量較其他兩種方法少,蛋白條帶不清晰,分布不均勻,主要集中在低分子量14.4～45.0kDa范圍;超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法提取的樣品中蛋白質(zhì)條帶豐富,分布均勻,但條帶不很清晰,泳道兩側(cè)拖帶嚴(yán)重,推測(cè)可能是部分降解所致;液氮冷凍研磨法提取的樣品中蛋白質(zhì)數(shù)量與超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法提取的蛋白質(zhì)數(shù)量基本一致,蛋白條帶豐富,分布均勻,條帶清晰。三種方法提取樣品的蛋白質(zhì)濃度分別為:9.95±0.41、17.47±0.39和15.85±0.54mg/g菌絲。根據(jù)電泳圖譜和蛋白質(zhì)濃度來(lái)比較,認(rèn)為方法Ⅲ的提取方法適合靈芝菌絲體蛋白質(zhì)組的制備。

為了優(yōu)化方法Ⅲ,提取液I中使用不同種類和不同濃度的蛋白酶抑制劑,分析所提蛋白質(zhì)的質(zhì)量,其結(jié)果表明(圖3):5種濃度的蛋白酶抑制劑混合物和20mmol/L PMSF所提取的蛋白質(zhì)樣品的電泳圖譜沒有明顯差異,蛋白質(zhì)條帶都比較清晰且條帶的豐富性較好,條帶分布均勻;所有樣品的蛋白質(zhì)濃度均不存在顯著性差異(表1)。從結(jié)果可以判斷,PMSF和蛋白酶抑制劑混合物均能很好地抑制靈芝菌絲內(nèi)源的蛋白酶,防止所提取蛋白質(zhì)降解,且與蛋白酶抑制劑混合物的濃度無(wú)關(guān)。

3 討論

在靈芝蛋白質(zhì)組學(xué)及靈芝轉(zhuǎn)基因菌株生產(chǎn)重組蛋白的研究中,獲取菌絲胞內(nèi)蛋白質(zhì),并保持其完整性是研究的首要問題,其質(zhì)量的好壞直接影響蛋白質(zhì)表達(dá)分析研究的開展及其結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,建立一種高效的菌絲體總蛋白的提取方法對(duì)作為“模式藥用真菌”靈芝生物學(xué)研究具有十分重要的作用。

真菌的細(xì)胞壁破碎是提取蛋白質(zhì)效果好壞的關(guān)鍵。已知靈芝細(xì)胞壁具有堅(jiān)固的雙層結(jié)構(gòu),由肽聚糖骨架組成,聚糖鏈上所存在的肽鍵數(shù)量多、交聯(lián)程度緊密,結(jié)構(gòu)十分致密堅(jiān)韌,不易破碎[13]。據(jù)文獻(xiàn)介紹,破碎靈芝孢子及子實(shí)體的方法有液氮研磨法[7]、超聲波法[14]及機(jī)械粉碎法[8,15]等三種。超聲波破壁法操作簡(jiǎn)單,但耗時(shí)較長(zhǎng)且操作過程中產(chǎn)生的熱量可能造成蛋白質(zhì)降解;液氮冷凍研磨法,成本低且低溫條件可避免蛋白質(zhì)降解[16];機(jī)械粉碎法即采用萬(wàn)能粉碎機(jī)將烘干的子實(shí)體及孢子粉碎成細(xì)小粉末,適合制藥業(yè)生產(chǎn)[15]。本研究采用超聲波法、超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法及液氮研磨法等三種不同細(xì)胞壁破碎的方法,其結(jié)果表明,三種方法均能破碎靈芝菌絲細(xì)胞,得到胞內(nèi)蛋白質(zhì)(圖2),但是超聲波法提取的樣品中蛋白質(zhì)數(shù)量較少,有部分蛋白質(zhì)降解現(xiàn)象;超聲波聯(lián)合液氮冷凍研磨法提取的樣品雖然蛋白質(zhì)數(shù)量較多,同樣有部分蛋白質(zhì)降解。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí),已考慮到超聲波發(fā)熱引起蛋白質(zhì)降解的問題,實(shí)驗(yàn)樣品處于冰浴,但結(jié)果還是出現(xiàn)一定程度蛋白損傷。因此,今后使用超聲波法破碎靈芝菌絲細(xì)胞時(shí)需要優(yōu)化超聲波功率、超聲波工作時(shí)間及間隔時(shí)間,以保證所提蛋白質(zhì)的數(shù)量及完整性[17]。與劉曉云[7]用液氮冷凍研磨法提取靈芝子實(shí)體原基的報(bào)道相似,本文發(fā)現(xiàn)液氮冷凍研磨法提取的蛋白質(zhì)樣品條帶豐富,分布均勻,在分子量14.4～116.0kDa區(qū)間內(nèi)分布大量的清晰蛋白帶,且蛋白濃度達(dá)到15.85±0.54mg/g。因此,認(rèn)為液氮冷凍研磨法比其它兩種方法更適合于靈芝菌絲蛋白質(zhì)組的制備。

蛋白質(zhì)提取常使用含變性劑、表面活性劑和還原劑等成分的提取液,其中常用于真菌總蛋白質(zhì)提取的方法有尿素-硫脲法[11,18]。變性劑如尿素可以使蛋白質(zhì)變性,形成完全隨機(jī)的構(gòu)象并暴露所有離子基團(tuán)于溶液中,因此可增加蛋白質(zhì)的溶解度;硫脲則可輔助尿素對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性,同時(shí)增加膜蛋白的溶解度,以制備包含更完整蛋白質(zhì)組的樣品,提高蛋白質(zhì)組的完整性[18]。因此,本文參考胡斌斌[11]報(bào)道的方法,在提取液Ⅰ中使用高濃度的尿素結(jié)合硫脲對(duì)靈芝菌絲蛋白質(zhì)進(jìn)行4℃低溫60min的溶解,最大限度提高總蛋白的數(shù)量;隨后在提取液Ⅱ中進(jìn)一步使用表面活性劑CHAPS和SDS來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解、還原劑DTT則可保持二硫鍵處于還原狀態(tài),增加蛋白質(zhì)溶解度。另外,為了防止蛋白質(zhì)降解、保持蛋白質(zhì)完整性,實(shí)驗(yàn)中比較了PMSF和不同濃度的蛋白酶抑制劑混合物對(duì)增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3和表1),兩種蛋白酶抑制劑均能很好地抑制靈芝菌絲內(nèi)源的蛋白酶,有效地阻止了蛋白質(zhì)降解,且不同濃度的蛋白酶抑制劑混合物作用相同。

綜上所述,本文建立了一種穩(wěn)定高效的靈芝菌絲體總蛋白的提取方法,可滿足靈芝蛋白質(zhì)組學(xué)的定量分析的需要。

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