王曉輝，張慶芳，遲乃玉

(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連，116622)

纖維素是公認(rèn)的地球上分布最廣、含量最豐富的可再生資源，利用廉價(jià)的可再生木質(zhì)纖維素可轉(zhuǎn)化成葡萄糖，并進(jìn)一步生成可再生生物能源如乙醇或其他有用物質(zhì)等。工業(yè)生產(chǎn)中主要采用濃硫酸等將長鏈多聚物纖維素降解為單糖，但所用強(qiáng)酸造成環(huán)境嚴(yán)重污染，因此亟需高效率、無污染的纖維素酶替代化學(xué)方法。但目前纖維素酶催化效率較低、生產(chǎn)成本較高，影響了纖維素酶工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用［1］。

纖維素酶是能夠降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱。主要分為3類:內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC3．2．1．4，EG)、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(exo-1，4-β-D-glucanases，EC3．2．1．9，CBH) 和 β-葡 萄 糖 苷 酶 (β-glucosidases，EC3．2．1．21，BG)［2-3］。纖維素酶水解纖維素是纖維素酶3種組分協(xié)同作用的結(jié)果:EG負(fù)責(zé)進(jìn)攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖苷建，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素;CBH負(fù)責(zé)從纖維素線狀分子非還原性末端水解切下纖維二糖單位;BG則將纖維二糖水解為葡萄糖，使纖維素完全降解。由于纖維素多樣性及高度復(fù)雜性，纖維素酶系降解機(jī)理還有待進(jìn)一步研究［4-5］。

為了研究纖維素酶之間的協(xié)同作用，需要獲得各種純的纖維素酶制劑。已報(bào)道從黑曲霉真菌培養(yǎng)液中分離純化天然纖維素酶［6-8］，但常常存在其他微量多糖水解酶的干擾，最好的辦法是利用基因工程菌表達(dá)纖維素酶。很多纖維素酶在真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞中成功表達(dá)，但絲狀真菌細(xì)胞存在內(nèi)源纖維素酶干擾問題，酵母細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)源果膠酶，影響外源基因表達(dá)［9-10］，因而探討纖維素酶在原核細(xì)胞中異源表達(dá)有重要意義。內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶系的重要組成部分，占表達(dá)的纖維素酶總量的5%～10%，是最重要的內(nèi)切酶之一，它具有很高的催化活性，被廣泛用于紡織、印刷、染料、造紙和洗滌等工業(yè)［11］。本文報(bào)道來自黑曲霉(Aspergillus niger)DL08內(nèi)切葡聚糖酶基因首次在大腸桿菌中異源重組表達(dá)，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為實(shí)現(xiàn)其與外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因重組并在一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控下完成基因串聯(lián)表達(dá)，最終獲得纖維素高效降解工程菌鑒定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

黑曲霉(A．niger)DL08菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存;大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α和BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存，分別為基因克隆和表達(dá)宿主菌;質(zhì)粒 pMDl9-T(TaKaRa)用作克隆載體，pET28a(Novagen)用作表達(dá)載體;引物合成和基因測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆與轉(zhuǎn)化

PDA液體培養(yǎng)基活化黑曲霉菌種，取1 mL接入50 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h后離心收集菌體。用濾紙吸干水分后，加入液氮研磨至粉末狀，按照Takara公司的RNA抽提試劑抽提黑曲霉總RNA，并采用cDNA合成試劑盒得到 cDNA。根據(jù) Jiong等［12］發(fā)表的內(nèi)切葡聚糖酶基因序列(GeneBank AF331518)設(shè)計(jì)引物，正義引物(5’-GAATTCATGAGGCTTCAGAGCACTCTGCTTCTTG-3’)包含EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)，反義引物(5’-AAGCTTTCAGCGATATGCCTC CAGGAT-3’)包含HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)，使用PrimeSTARTMHS DNA Polymerase(Takara)擴(kuò)增得到不含信號(hào)肽的內(nèi)切葡聚糖酶基因cDNA序列。將該cDNA序列連接到pMDl9-T載體，構(gòu)建pMDl9-T-eg1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E．coli DH5α，得到陽性轉(zhuǎn)化子。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ將eg1基因片段從pMDl9-T-eg1上切下，連接到pET-28a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至E．coil BL21(DE3)，通過菌落PCR、酶切篩選鑒定陽性克隆子，命名為pET28a-eg1。

1.3 內(nèi)切葡聚糖酶基因的表達(dá)與純化

將重組E．coil BL21(DE3)接入含卡那的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)14 h。按1%的接種量接種到含卡那的LB培養(yǎng)基中。當(dāng)OD600nm達(dá)到0．8左右，加入0．2 mmol/L的IPTG，15 ℃，100 r/min低溫誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，4℃，5，000×g，4 ℃離心 5 min，收集菌體，用10 mL，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl(pH 8．0)洗滌菌體3次。最后用10 mL含1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，20 mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl(pH8．0)的緩沖液重懸菌體。離心管置于冰上超聲(400 W)破碎3次，每次30 s，每次間隔1min。4℃，8 000×g離心20 min，收集上清液，即為粗蛋白。粗蛋白用Ni2+-NTA柱(Novagen)進(jìn)行親和層析純化，洗脫的蛋白液轉(zhuǎn)至透析袋(25 mm×16 mm，Sigma-Aldrich)在50 mmol/L Tris-HCl(pH 5．0)緩沖液中4℃過夜透析。蛋白樣品經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)［13］檢測，其中濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12%，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。低分子量蛋白 Marker(TakaRa)用于 SDSPAGE。

1.4 蛋白質(zhì)濃度測定

蛋白濃度通過Bradford蛋白濃度測定試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)(碧云天公司)測定。

1.5 內(nèi)切葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)測定

1．5．1 內(nèi)切葡聚糖酶的酶活測定

內(nèi)切葡聚糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸試劑(DNS)法［14］測定。反應(yīng)體系為:0．3 mL，50 mmol/L Tris-HCl buffer(pH8．5)，90 μL，1% 羧甲基纖維素鈉和適量重組內(nèi)切葡聚糖酶，45℃反應(yīng)30 min。加0．8 mL，0．4 mmol/L DNS試劑終止反應(yīng)，100 ℃ 加熱 10 min顯色，然后檢測在520 nm處的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得到還原糖濃度。酶活力單位(U)定義為:在上述條件下每分鐘催化底物生成1 μmol還原糖所需酶量為1個(gè)活力單位。

1．5．2 內(nèi)切葡聚糖酶反應(yīng)的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

將加入羧甲基纖維素鈉的酶液在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃下反應(yīng) 30 min 測酶活，確定酶反應(yīng)的最適溫度。將最高酶活定義為100%。熱穩(wěn)定性的測定是將酶液分別置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃下保溫1 h 測酶活，將最高酶活定義為100%。

1．5．3 內(nèi)切葡聚糖酶反應(yīng)的最適pH和pH穩(wěn)定性

最適pH測定所用緩沖液為:50 mmol/L phosphate-citrate(pH 4．0～5．0)，50 mmol/L Tris – HCl(pH 6．0～10．0)，反應(yīng)體系為:90 μL，1% 羧甲基纖維素鈉，10 μL 酶液，300 μL 不同 pH 的緩沖液，45 ℃反應(yīng)30 min測酶活，將最大酶活設(shè)為100%。pH穩(wěn)定性的測定:將酶保存于不同pH值的緩沖液中，于4℃放置24 h后在最適pH值和最適溫度下測定酶活，以酶活最高為100%。

1.6 酶作用產(chǎn)物分析

硅膠薄層層析(TLC)法分析酶解產(chǎn)物。水解條件:1%羧甲基纖維素鈉，0．1 mg重組內(nèi)切葡聚糖酶和0．01%(w/v)NaN3，45 ℃反應(yīng)，分別于 4，8，12 和24 h取樣。各取10 μL點(diǎn)樣于薄層層析硅膠板上，用丙酮∶異丙醇∶水 =6∶3∶1．5作為展開劑，用吹風(fēng)機(jī)吹干硅膠板，均勻噴灑顯色劑(4 g二苯胺，4 mL苯胺與20 mL，85%磷酸溶于200 mL丙酮)，180℃烘烤3 min，顯色。lmg/mL葡糖糖作為標(biāo)準(zhǔn)液。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆與鑒定

以黑曲霉(A．niger)總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增，得到1條長度約1000bp的 DNA片段(圖1)。DNA測序結(jié)果表明:該基因包含999個(gè)核苷酸構(gòu)成的開放閱讀框架，命名為eg1，該基因編碼332個(gè)氨基酸，GC 堿基含量為53．95%，理論分子量36．75 kDa，等電點(diǎn)為4．38。Blast比對分析該序列同已發(fā)表A．niger內(nèi)切葡聚糖酶 (GeneBank No．AF331518)氨基酸同源性達(dá)96%。已將此基因登陸GenBank，序列號(hào)為KJ437592。結(jié)構(gòu)域分析［17］該基因包含一段18個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽，屬于糖苷水解酶5家族。將目的基因eg1連接表達(dá)載體pET28a，酶切鑒定成功構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-eg1(圖2)。

圖1 內(nèi)切葡聚糖酶基因的PCR擴(kuò)增Fig．1 Agarose gel electrophoresis of the eg1 gene through PCR

圖2 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物回收Fig．2 Enzyme digestion of plasmid pET28a-eg1

2.2 重組內(nèi)切葡聚糖酶表達(dá)與純化

重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a-eg1轉(zhuǎn)化至宿主菌E．coli BL21(DE3)，0．2 mmol/L IPTG，100 r/min，15℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)6 h，超聲破碎后蛋白5．23 mg，全部以可溶蛋白表達(dá)，未見包涵體形式，表明該重組蛋白成功表達(dá)(見圖3)，比活力為68．9 U/mg。利用設(shè)計(jì)好的內(nèi)切葡聚糖酶基因C端融合6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，通過Ni+-NTA親和層析法純化分離重組內(nèi)切葡聚糖酶(見圖4)。SDS-PAGE檢測顯示該重組蛋白純化后得到單一條帶，大小約36 kDa，與預(yù)期大小一致。蛋白含量2．85 mg，純化倍數(shù)為1．31，回收率達(dá)59．2%，比活力高達(dá) 90．3 U/mg(見表 1)。

圖3 重組內(nèi)切葡聚糖酶蛋白SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig．3 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)of the recombinant eg1

表1 內(nèi)切葡聚糖酶重組蛋白純化總結(jié)Table 1 Purification summary of the recombinant eg1

2.3 重組內(nèi)切葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究

由圖5(a)可以看出，反應(yīng)溫度在40～60℃時(shí)該酶有較高的活性，溫度低于40℃或者高于60℃，酶促反應(yīng)速率顯著下降，酶的最適反應(yīng)溫度為45℃;30～60℃區(qū)間酶的穩(wěn)定性較好，其相對酶活都大于80%，說明該酶具有較好的熱穩(wěn)定性;由圖5(b)可以看出，該酶最適 pH為5．0，pH大于7．0酶的活力有所下降;該酶在3．0～12．0范圍內(nèi)有較好的活性，保持50%以上的酶活性，pH在表明內(nèi)切葡聚糖酶pH耐受性范圍較廣。

圖5 內(nèi)切葡聚糖酶重組蛋白酶學(xué)特性Fig．5 Enzymatic profiles of recombinant endo-β-1，4-glucanase eg1．

2.4 重組內(nèi)切葡聚糖酶酶解產(chǎn)物分析

純化的重組蛋白eg1在45℃酶解1%羧甲基纖維素鈉，分別于2，4，12，24 h 取 10 μL 溶液進(jìn)行產(chǎn)物分析。以l mg/mL的葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)液(見圖4)，從圖4看出，該酶的酶解產(chǎn)物為連續(xù)的寡糖，而非單一分子質(zhì)量的單糖產(chǎn)物，說明該酶為內(nèi)切葡聚糖酶。

3 討論

異源表達(dá)蛋白尤其是來自真核生物的蛋白在大腸桿菌中往往不能正確折疊，而聚集成不溶性的形式即包涵體，造成這些蛋白在大腸桿菌中不能正確表達(dá)［15］。研究者采用很多措施改善或提高蛋白的正確折疊效率包括共表達(dá)同源或異源的折疊輔助蛋白、菌體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及表達(dá)融合蛋白等，其中培養(yǎng)條件的優(yōu)化是最簡單有效促進(jìn)蛋白正確折疊的方法，包括誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)溫度或搖床轉(zhuǎn)數(shù)等方面，而優(yōu)化低溫誘導(dǎo)是一種常見有效的提高蛋白折疊的策略，其原理可能涉及很多因素，如蛋白自聯(lián)作用力的減弱、蛋白合成速度的降低以及多肽鏈折疊動(dòng)力學(xué)的改變等［16］。本研究中內(nèi)切葡聚糖酶在37℃誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)重組蛋白幾乎全部以不溶性的包涵體形式表達(dá)，當(dāng)采用15℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)可溶性的重組蛋白。

圖6 內(nèi)切葡聚糖酶酶解產(chǎn)物薄層層析Fig．6 TLC analysis of the oligosaccharides from the endo-β-1，4-glucanase hydrolysates

本研究內(nèi)切葡聚糖酶以羧甲基纖維素鈉為底物測酶活，比活力達(dá)90．3 U/mg，最適作用溫度45℃，為中溫酶;最適 pH 為 5．0，在 pH 3．0～12．0 酶活較穩(wěn)定，即使在強(qiáng)堿性環(huán)境下仍保持50%以上的活性。以羧甲基纖維素鈉為底物分析水解產(chǎn)物表明4h的酶解產(chǎn)物已產(chǎn)生淡淡斑點(diǎn)，即產(chǎn)生連續(xù)低聚寡糖，12和24 h酶解產(chǎn)物相比4 h產(chǎn)生更多斑點(diǎn)，說明隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行產(chǎn)生濃度更高的低聚寡糖，12 h與24 h酶解產(chǎn)物的斑點(diǎn)并未明顯區(qū)別，表明該酶于12 h已反應(yīng)完全，所以24 h的酶解產(chǎn)物在TLC板上并未產(chǎn)生新的斑點(diǎn)，即未產(chǎn)生新的相應(yīng)低聚寡糖。本研究內(nèi)切葡聚糖酶酶解1%羧甲基纖維素鈉終產(chǎn)物為連續(xù)寡糖，并非單一分子質(zhì)量的單糖，說明該酶為內(nèi)切葡聚糖酶。

本研究利用誘導(dǎo)型T7啟動(dòng)子控制內(nèi)切葡聚糖酶基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了過量表達(dá)，初步研究重組蛋白的酶學(xué)特性，并對其降解產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，目前正在對該酶的酶學(xué)性質(zhì)作更深入的研究，為實(shí)現(xiàn)其與外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因重組并在一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控下完成基因串聯(lián)表達(dá)，最終獲得纖維素高效降解工程菌鑒定基礎(chǔ)。

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