劉賀，李君，庚平，朱丹實(shí)，慧麗娟，王勃，何余堂，馬濤

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，遼寧錦州，121013)

干酪是世界上消費(fèi)最大的農(nóng)產(chǎn)品之一，2012年就超過(guò)2 000萬(wàn)t，全球市場(chǎng)預(yù)計(jì)超過(guò)了600億美元［1］。在傳統(tǒng)的Cheddar干酪生產(chǎn)過(guò)程中，酪蛋白凝乳的結(jié)構(gòu)形式會(huì)使乳清蛋白流失，乳清蛋白是眾所周知的具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和多功能性的食品。乳清蛋白的營(yíng)養(yǎng)和功能特性與其結(jié)構(gòu)和生物功能相關(guān)［2］。主要的乳清蛋白有β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，分別占乳清蛋白總量的50%和20%，其余部分主要由免疫球蛋白、牛血清白蛋白、蛋白胨和一些小蛋白分子構(gòu)成［3］。乳清蛋白集合到干酪中不僅可以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和產(chǎn)量，同時(shí)也改變了奶酪的功能性質(zhì)。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)是食品和藥物管理局(FDA，2010)公認(rèn)的安全可食用的添加劑［4］。它可以催化轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)(或多肽)之間發(fā)生共價(jià)交聯(lián);它還可以使蛋白質(zhì)改性，以使蛋白質(zhì)的塑性、持水性、水溶性和功能性得到改善;還可以保護(hù)食品中的賴(lài)氨酸免受各種化學(xué)反應(yīng)的破壞等。凝乳是干酪制作的重要環(huán)節(jié)，顯著影響干酪的理化性質(zhì)，任何使酪蛋白膠束、脂肪分子、水分子、礦物質(zhì)等發(fā)生變化的工藝過(guò)程都有可能造成干酪流變學(xué)特性與質(zhì)地的變化［5］。然而凝乳是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，只有連續(xù)監(jiān)測(cè)才能準(zhǔn)確揭示其膠體結(jié)構(gòu)和狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。

本實(shí)驗(yàn)將TGase與凝乳酶同時(shí)作用牛乳，通過(guò)微流變儀觀察和分析牛乳凝乳形成過(guò)程中真實(shí)的內(nèi)在變化。本研究還跟蹤干酪發(fā)酵周期，以測(cè)定不同含量TGase對(duì)Cheddar干酪發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)特性的影響，以及通過(guò)低場(chǎng)核磁檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中水分的分布情況。同時(shí)采用流變儀研究添加TGase對(duì)成熟后的Cheddar干酪流變特性的影響規(guī)律。從凝膠結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性來(lái)探討TGase對(duì)干酪凝乳形成及對(duì)干酪品質(zhì)的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮奶來(lái)自光明牧場(chǎng);凝乳酶FROMASE 750 XLG，荷蘭帝斯曼公司;直投式干酪發(fā)酵劑CHOOZIT RA21 LYO 50 DCU，丹麥丹尼斯克公司;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)，丹麥丹尼斯克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀TA-XT plus，英國(guó)SMS;核磁共振成像儀NMI20，中國(guó)紐邁電子科技有限公司;流變儀DHR-1，美國(guó)TA儀器公司;微流變儀Rheolaser Lab，法國(guó)Formulaction公司。

1.3 切達(dá)干酪制備

將鮮牛乳于72℃巴氏殺菌后使用，向冷卻的牛乳中加入發(fā)酵劑0．004 g/L，攪拌均勻，水浴靜置在32℃。當(dāng)pH降到6．4～6．5時(shí)加入凝乳酶3 000 u/mL，凝乳30～35 min。對(duì)照組同時(shí)分別添加15 u/L(TG1)、30 u/L(TG2)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。切割后用攪拌刀將凝乳塊推開(kāi)，每2～3 min升溫1℃，緩慢升高到41℃。恒溫?cái)嚢瑁敝寥榍錺H降到5．6～5．7。用60目的濾布分離乳清和凝乳，將凝乳粒堆疊在干酪槽的中部，每隔10 min翻動(dòng)1次，進(jìn)一步排除乳清，直至乳清pH值達(dá)到5．2～5．3為止。將堆砌的干酪切成3 cm大小立方體，添加2%NaCl，混合均勻。入模壓榨12 h后將干酪從模具中取出，真空包裝，并于4℃保藏。

1.4 凝乳過(guò)程微流變測(cè)定

牛乳發(fā)酵pH降到5．4～5．5時(shí)，添加凝乳酶和TGase，將樣品倒入樣品池中。樣品體積20 mL，溫度32℃，分析時(shí)長(zhǎng)15 h。取樣時(shí)要盡量避免過(guò)大的剪切力，通過(guò)Rheolaser直接分析。

1.5 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

分別取1～6個(gè)月的干酪樣品，室溫下放置30 min。TPA測(cè)定參數(shù):每組干酪切割為規(guī)則正方體(1．5 cm×1．5 cm×1．5 cm);測(cè)量前探頭下降速率 1 mm/s;測(cè)試速率 5 mm/s;測(cè)試后探頭回程速率 5 mm/s;下壓高度為樣品高度的35%;觸發(fā)力5 g;探頭類(lèi)型P100。剪切力測(cè)定參數(shù):測(cè)量前探頭下降速率0．5 mm/s;測(cè)試速率0．5 mm/s;測(cè)試后探頭回程速率10 mm/s;下降距離為25 mm;觸發(fā)力50 g;探頭類(lèi)型A/BC。每組樣品測(cè)定3次。

1.6 NMR自旋-自旋弛豫時(shí)間測(cè)定

圖1 TGase對(duì)牛奶凝乳過(guò)程微流變的影響Fig．1 Effect of TGase on micro rheological process of milk curd

干酪樣品在4℃溫度下保存，分別在貯存的第1、2、4、6月測(cè)定樣品的自旋 -自旋弛豫時(shí)間 T2(ms)。每組奶酪切割為規(guī)則長(zhǎng)方體(0．5 cm×0．5 cm×1．5 cm)，裝于15 mm 外徑的試管底部，置于磁場(chǎng)中心位置的射頻線圈的中心。參數(shù)設(shè)定:重復(fù)時(shí)間TR=1 500 ms;半回波時(shí)間τ=300 μs;累加次數(shù)NS=8;回波個(gè)數(shù)EchoCnt=4 000。CMPG指數(shù)衰減曲線用儀器自帶的MultiExp Inv Analysis軟件進(jìn)行反演，得到T2值。

1.7 干酪成熟末期流變測(cè)定

取一定量干酪放在85℃樣品池中融化，選用直徑40 mm的不銹鋼平行板系統(tǒng)，板間距為1 500 μm。變溫振蕩掃描:剪應(yīng)變0．5%，頻率1．0 Hz，降溫速率為2．5℃/min，降溫范圍由85℃至20℃，每10 s儀器會(huì)自動(dòng)采集1次數(shù)據(jù)。頻率振蕩掃描:剪應(yīng)變0．5%，溫度20 ℃，頻率取0．1～10 Hz。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝乳過(guò)程微流變測(cè)定

通過(guò)Rheolase可以觀察到樣品黏彈性、流動(dòng)性隨時(shí)間的變化，明晰TGase在凝乳過(guò)程的作用(圖1)。

圖1(A)顯示了彈性因子(EI)隨凝乳時(shí)間的變化。初始階段，在凝乳酶的作用下，3組干酪的彈性因子均緩慢上升，對(duì)照組的EI值大于TG1、TG2。凝乳10 min后，對(duì)照組EI值顯著上升，首先達(dá)到最高的強(qiáng)度。添加TGase含量越高EI值越小，說(shuō)明TGase在凝乳過(guò)程中減弱了凝乳的強(qiáng)度。圖1(B)表明不同樣品的宏觀黏度指數(shù)(MI)隨凝乳時(shí)間的變化。凝乳30 min之內(nèi)，MI值緩慢增加，TGase含量對(duì)樣品粘性沒(méi)有影響，此時(shí)酪蛋白在凝乳酶作用下形成凝膠，這種凝膠體系是靠很弱的非共價(jià)鍵，主要是氫鍵來(lái)維持。30 min之后，TG2 MI值顯著高于TG1及對(duì)照組，表明此時(shí)TGase在乳蛋白的分子內(nèi)或分子間形成ε-(γ-谷氨酰)賴(lài)氨酸鍵結(jié)合了乳清蛋白分子，使通常條件下不能形成凝膠的乳蛋白形成凝膠，引入了新的共價(jià)鍵，使凝膠特性發(fā)生很大改變。圖1(C)表示流動(dòng)指數(shù)(FI)隨時(shí)間的變化，凝乳30 min內(nèi)屬于凝膠結(jié)構(gòu)恢復(fù)階段，樣品FI隨時(shí)間變化不斷的減小，表明樣品結(jié)構(gòu)在不斷地恢復(fù)，待穩(wěn)定之后即為樣品本身的彈性。對(duì)照組流動(dòng)指數(shù)最小，說(shuō)明TGase含量會(huì)提升凝乳的流動(dòng)性，TGase含量越高越不利于凝膠結(jié)構(gòu)恢復(fù)。隨凝乳時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組及TG1達(dá)到平衡，結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，TG2 FI值迅速下降達(dá)到最小值，說(shuō)明此時(shí)TGase交聯(lián)乳清蛋白分子具有更致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和較小的蛋白顆粒膠束，并且膠團(tuán)間空隙較小，導(dǎo)致較低的脫水收縮作用，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。圖1(D)表明了凝固時(shí)間，對(duì)照組5 min后達(dá)到固液平衡點(diǎn)(SLB)0．5，形成凝膠，TGase含量越高形成凝膠的時(shí)間越長(zhǎng)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，SLB值越來(lái)越小，表明凝膠結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

2.2 不同儲(chǔ)存期干酪質(zhì)構(gòu)的變化

干酪的質(zhì)構(gòu)特征是表征干酪成熟變化的重要指標(biāo)，它與干酪的組成、成熟度、結(jié)構(gòu)以及分子間的作用力等有關(guān)［6］。表1中列出了儲(chǔ)存1～6個(gè)月、不同TGase含量的干酪TPA檢驗(yàn)的質(zhì)構(gòu)參數(shù)。從TPA質(zhì)構(gòu)曲線中可以得到與人的感官評(píng)價(jià)相關(guān)的質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)。3組干酪在成熟1～3個(gè)月期間其硬度、黏著性、咀嚼性和剪切力均升高，在成熟3個(gè)月時(shí)達(dá)到最大值，成熟后期(4～6月)程下降趨勢(shì)。這是由于干酪成熟前期水分的流失和微生物的新陳代謝作用，使含水量不斷下降，導(dǎo)致干酪質(zhì)地變硬，而隨著干酪成熟的進(jìn)行，Cheddar中的蛋白質(zhì)和脂肪被微生物和酶不斷降解，如 αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和 κ-酪蛋白緩慢發(fā)生降解［7］，整體干酪體系變得松散，硬度、黏著性、咀嚼性隨著下降。添加TGase顯著提升了干酪的硬度、剪切力(P＜0．05)，圖2的 NMR分析表明，添加TGase降低了游離水峰面積的比例，說(shuō)明TG1、TG2含有較少的水分含量，導(dǎo)致干酪硬度增加。另一方面是因?yàn)棣?酪蛋白分子位于酪蛋白膠束的表面，其中有4個(gè)谷氨酸殘基能夠作為T(mén)Gase潛在的交聯(lián)位點(diǎn)，從而使 κ-酪蛋白能夠被 TGase交聯(lián)［8］，形成新的共價(jià)鍵，減少了酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的分解，提升了干酪的硬度和剪切力等。TGase對(duì)干酪的彈性影響不顯著。由于硬度增加，直接導(dǎo)黏著性和咀嚼性顯著增加(P＜0．05)，而添加30 u/L TGase黏著性小于添加15 u/L TGase，可能是因?yàn)門(mén)Gase含量過(guò)高阻礙了蛋白質(zhì)降解為肽鏈和氨基酸，而這些蛋白質(zhì)的降解物親水基團(tuán)較多，對(duì)干酪的黏著性起到貢獻(xiàn)作用。添加TGase后，酪蛋白和脂肪分解成小分子物質(zhì)過(guò)程中酪蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞較輕，所以在咀嚼性上沒(méi)有對(duì)照組口感細(xì)膩。

表1 TGase對(duì)Cheddar干酪在成熟過(guò)程中質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effect of TGase on texture of Cheddar cheese during ripening

2.3 干酪成熟過(guò)程水分分布的變化

圖2 TGase對(duì)Cheddar干酪在成熟過(guò)程中水分分布的影響Table 2 Effect of TGase on moisture distribution of Cheddar cheese during ripening

CPMG脈沖序列檢測(cè)到干酪中兩部分水分的弛豫性質(zhì)，指數(shù)衰減曲線擬合得到2個(gè)峰，即T21、T22如圖2所示。圖2為不同成熟期Cheddar干酪水分分布隨貯藏時(shí)間的變化情況。自旋-自旋弛豫時(shí)間越長(zhǎng)表示這部分水分的流動(dòng)性越強(qiáng)，T21的弛豫時(shí)間變化范圍在8～87 ms，代表與干酪中的蛋白質(zhì)結(jié)合緊密的結(jié)合水;T22弛豫時(shí)間變化范圍為57～201 ms，代表與干酪中的蛋白質(zhì)結(jié)合松散的自由水。結(jié)合水部分所占的峰比例較高，占總峰比例的83．6%～94．8%，是干酪中存在的第一大類(lèi)水分，其變化也影響著干酪的品質(zhì)與結(jié)構(gòu)。隨著貯藏時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生水解，T21弛豫時(shí)間延長(zhǎng)，峰面積比例變大，說(shuō)明結(jié)合水的比例變大且流動(dòng)性增強(qiáng)。成熟過(guò)程中TG2弛豫時(shí)間小于 TG1，整體小于對(duì)照組，這是因?yàn)門(mén)Gase含量高的樣品的氫質(zhì)子和大分子(主要是蛋白質(zhì))結(jié)合更緊密，而蛋白質(zhì)的聚集會(huì)降低氫質(zhì)子的弛豫時(shí)間，是因?yàn)榕紭O子之間的相互作用變?nèi)?，所以生物大分子阻礙了水分子的移動(dòng)［9］。T22對(duì)應(yīng)干酪中的自由水，TGase對(duì)自由水的影響較顯著，可以明顯看出峰的移動(dòng)規(guī)律。對(duì)照組干酪自由水弛豫時(shí)間最長(zhǎng)，游離出來(lái)的水束縛能力薄弱，添加TGase后峰向左移動(dòng)，改善了游離水的自由度。峰面積的比例有減小的趨勢(shì)，說(shuō)明這部分水的流動(dòng)性變差，對(duì)照組變化較明顯。

2.4 TGase添加量對(duì)干酪流變性的影響

干酪具有黏彈性，體現(xiàn)在既具有固體的彈性，又具有液體的黏性，干酪的質(zhì)地受流變學(xué)特性影響很大［10］。G＇稱(chēng)為動(dòng)力學(xué)剪切的彈性模量，是每次剪切變形中可恢復(fù)的能量，代表物質(zhì)的彈性部分。由圖3可以看出，不同TGase含量干酪的彈性模量變化趨勢(shì)相似，在20～85℃下隨著溫度的升高迅速下降，溫度升高，脂肪流動(dòng)性增強(qiáng)，干酪的流變特性趨于黏性而非堅(jiān)硬性。當(dāng)溫度升高到60℃時(shí)，彈性模量下降平緩。隨著TGase濃度的增大，彈性模量升高，在升溫過(guò)程中，對(duì)照組變化幅度最小，最先達(dá)到平穩(wěn)，這可能是由于TGase交聯(lián)更多的乳清蛋白大分子，導(dǎo)致干酪蛋白與脂肪的比例發(fā)生變化，而脂肪含量在干酪的熔化中占有非常重要的作用，它可以降低酪蛋白網(wǎng)絡(luò)密集，所以對(duì)照組更快的發(fā)生延伸和熔化。G"稱(chēng)為動(dòng)力學(xué)剪切的損耗模量，是每次剪切變形中消耗掉的能量，代表物質(zhì)的黏性部分。其變化趨勢(shì)同彈性模量相似，但變化值低于彈性模量。

圖3 升溫過(guò)程中TGase對(duì)Cheddar干酪模量的影響Fig．3 Effect of TGase on modulus of Cheddar cheese during heating

由圖4可以看出，干酪的彈性模量和損耗模量隨頻率的增大而增大，而TGase含量越高，干酪的彈性模量及損耗模量越高，說(shuō)明該產(chǎn)品的彈性部分和黏性部分都增加了。這種現(xiàn)象早有學(xué)者M(jìn)cMaho等表明，干酪生產(chǎn)中必須滿足酪蛋白與脂肪之比等于某個(gè)常數(shù)(此常數(shù)為0．95)。當(dāng)酪蛋白與脂肪比值降低時(shí)，所制作的干酪彈性模量降低，干酪變得發(fā)軟而缺乏彈性，甚至在表面析出油滴;當(dāng)酪蛋白與脂肪比值增加時(shí)，則會(huì)引起干酪發(fā)黏、發(fā)硬而使質(zhì)構(gòu)發(fā)生改變［11-12］。

3 結(jié)論

由于發(fā)酵過(guò)程中凝乳酶、微生物蛋白酶以及TGase等協(xié)同發(fā)揮作用，TGase能夠促進(jìn)分子間的或分子內(nèi)的交聯(lián)與聚合，形成新的共價(jià)鍵，所以對(duì)干酪的力學(xué)性質(zhì)及水分分布影響較大。隨TGase含量增加干酪硬度、咀嚼性及剪切力顯著增加，而黏著性降低，彈性則不受TGase處理的影響。成熟后末期，由于蛋白質(zhì)水解程度的增加，整體干酪體系變得松散，硬度、黏著性、咀嚼性隨著下降。TGase對(duì)自由水的影響顯著，發(fā)酵過(guò)程中TG2弛豫時(shí)間小于TG1，整體小于對(duì)照組，添加TGase后峰向左移動(dòng)，改善了游離水的自由度。在凝乳階段，添加TGase會(huì)降低凝乳的彈性因子，隨凝乳時(shí)間延長(zhǎng)，黏性顯著升高，TGase對(duì)流動(dòng)性的影響越明顯，流動(dòng)性顯著降低。TG1、TG2由于交聯(lián)更多的乳清蛋白大分子，脂肪比例降低，低溫時(shí)TG1和TG2模量較高，當(dāng)高溫時(shí)，均開(kāi)始出現(xiàn)了一個(gè)較平緩的幅度。頻率掃描中，干酪的黏彈性隨頻率的增加而增加，TGase含量越高，干酪的模量越高。

圖4 頻率掃描震蕩TGase對(duì)Cheddar干酪模量的影響Fig．4 Effect of TGase on modulus of Cheddar cheese during oscillation frequency sweep

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