張奧博

(北京市大峪中學(xué) 北京 102300)

1 DNA指紋技術(shù)綜述

1984年英國(guó)萊斯特大學(xué)遺傳學(xué)家Jefferys及其合作者首次通過(guò)DNA分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法獲得一系列可以在膠片上看到的圖紋。DNA指紋的圖像在X光膠片中呈一系列條紋,很像商品上的條形碼。DNA指紋圖譜,開(kāi)創(chuàng)了檢測(cè)DNA多態(tài)性的多種多樣的手段,如限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性[1]分析、串聯(lián)重復(fù)序列分析等。[2]各種分析方法均以DNA的多態(tài)性為基礎(chǔ),產(chǎn)生具有高度個(gè)體特異性的DNA指紋圖譜,由于DNA指紋圖譜具有高度的變異性和穩(wěn)定的遺傳性,且仍按簡(jiǎn)單的孟德?tīng)柗绞竭z傳,成為目前最具吸引力的遺傳標(biāo)記。

本文通過(guò)對(duì)該技術(shù)的研究,將其應(yīng)用在珍稀物種保護(hù)和打擊珍稀物種走私領(lǐng)域,有很強(qiáng)的應(yīng)用性。

2 研究實(shí)例

(1)研究對(duì)象。利用DNA指紋印跡技術(shù),對(duì)疑似黃唇魚(yú)的基因樣本進(jìn)行鑒定。(2)研究目的。利用生物學(xué)手段,使用DNA指紋印跡技術(shù),鑒別樣本所屬物種。(3)研究意義。DNA指紋印跡技術(shù)在刑事案件、法醫(yī)學(xué)上被廣泛的應(yīng)用,其不僅有助于人種、性別鑒定,而且還可用于器官移植的配型試驗(yàn)等范疇。(4)研究方法:①限制性核酸內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)每一限制性核酸內(nèi)切酶在切割DNA分子時(shí)都有固定的切點(diǎn)序列,DNA分子中核苷酸排列順序的變化有可能使該切點(diǎn)丟失或增加,用同一限制性內(nèi)切酶酶切后,所得DNA片段的長(zhǎng)度分布也是千變?nèi)f化的。這種酶切片段長(zhǎng)度分布的多樣性就稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),RFLP常用于生物群體的遺傳分析。②限制性核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶(Restriction endonuclease)是一類從原核生物中提取出的酶。它能夠特異性地識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種長(zhǎng)度為4-8bp的特定核苷酸序列,并由此處將DNA雙鏈切開(kāi)。③瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖,具親水性,不帶電荷,是很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中通過(guò)凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng),不同DNA分子片段由于分子量和分子構(gòu)型不同,在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率也不同。溴化乙錠(EB)可嵌入DNA分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物,經(jīng)紫外線照射后,可顯示出不同的熒光帶,達(dá)到分離、鑒定分子量,篩選重組子的目的。(5)實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)利用相關(guān)技術(shù),使用黃唇魚(yú)樣本,實(shí)現(xiàn)生物鑒種的相關(guān)應(yīng)用。首先,將提取好的DNA樣本用限制性內(nèi)切酶酶切成不同大小的DNA片段,按照下列步驟進(jìn)行:①制取瓊脂糖凝膠。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備,安裝電泳槽。將有電泳凝膠床洗凈,晾干,用膠帶將兩端的開(kāi)口封好,放在水平的工作臺(tái)上,插上樣品梳。然后,稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中,并加入EB,置沸水浴中加熱至完全溶化(不可加熱至沸騰),取出搖勻。最后,將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液倒入電泳槽水平板上。待瓊脂糖膠凝固后,在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液,拔出梳子。②電泳。首先,將A、B、C樣本DNA分別標(biāo)號(hào)為A、B、C,黃唇魚(yú)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣本標(biāo)號(hào)為S,DNA Maker標(biāo)號(hào)為M。然后,分別將DNA樣品、DNA標(biāo)準(zhǔn)樣本、LD5000DNA Maker與上樣緩沖液(loading buffer)混勻后,用微量移液器依次將混合液加到樣品槽中,每槽加5μl。將點(diǎn)樣完成的凝膠放入恒定電場(chǎng)中電泳約30分鐘。安裝好電極導(dǎo)線,點(diǎn)樣孔一端接負(fù)極,另一端接正極,打開(kāi)電源,調(diào)電壓至3-5V/cm,電泳30min后,停止電泳。最后,取出凝膠,放入凝膠成像系統(tǒng)觀察,有熒光條帶的位置,即為DNA條帶,照相記錄電泳圖譜。

3 結(jié)論及改進(jìn)方法研究

A樣本與黃唇魚(yú)樣本(S)的DNA圖像基本吻合,所以A樣本為黃唇魚(yú)

通過(guò)實(shí)驗(yàn),我們要研究能否在鑒別魚(yú)是否為黃唇魚(yú)的同時(shí),鑒定魚(yú)的種類及其在進(jìn)化樹(shù)上所處的生態(tài)位置。在此基礎(chǔ)上,還可以用PCR分析方法測(cè)出B、C樣品DNA片斷序列,并判斷魚(yú)的種類及其在進(jìn)化樹(shù)上所處的生態(tài)位置。

研究通過(guò):提取DNA樣本—設(shè)計(jì)保守序列通用引物—PCR擴(kuò)增—電泳—切取含某一長(zhǎng)度DNA片斷的凝膠塊回收DNA—將回收的DNA片斷交由專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行測(cè)序—將基因序列放入NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST比對(duì)的步驟。經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì),就可以得出B、C樣本魚(yú)的種類和其在進(jìn)化樹(shù)上所處的的生態(tài)位置。

4 結(jié)語(yǔ)

RFLP分析實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確度較低,只能定性觀察,無(wú)法判別B、C兩種魚(yú)種類;PCR分析實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng),但實(shí)驗(yàn)精確度較高,可以定量比對(duì),借助網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)可判定樣本種類及進(jìn)化程度。因此,DNA指紋技術(shù)在生物鑒種中的應(yīng)用可以有效地確定其生態(tài)位置,在很多相關(guān)領(lǐng)域都有重要意義。

[1]Thiermann,A.B.etal.Am.J.Vet.Res.限制性核酸片段多態(tài)性分析[A]1986,47:61-66.

[2]劉德立.DNA指紋圖譜法及其應(yīng)用[J]生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1990,27:6.