張玉霞，雍國(guó)新，黎淵珠，梁瓊

（1．海南工商職業(yè)學(xué)院應(yīng)用技術(shù)系，海南海口570203；2．?？诮?jīng)濟(jì)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，海南?？?570203）

近年來(lái)，世界人均蛋白質(zhì)的年供給量逐年有所增加，但多數(shù)來(lái)自動(dòng)物蛋白。與動(dòng)物蛋白相比較，植物蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，植物蛋白低脂肪無(wú)膽固醇，可有效防止動(dòng)物蛋白所導(dǎo)致的肥胖、腫瘤和心腦血管疾病的發(fā)生；第二，我國(guó)人多地少，糧食轉(zhuǎn)化為動(dòng)物蛋白的效率低，而植物蛋白的生產(chǎn)成本僅為動(dòng)物蛋白的15%左右；第三，將植物蛋白制品作為食品添加劑，可起到氨基酸互補(bǔ)的作用，是一種極具市場(chǎng)潛力的功能性保健食品[1]。鑒于此，開發(fā)植物蛋白成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究之一。

綠豆別名植豆、青小豆、吉豆，為豆科一年生草本植物。綠豆中富含蛋白質(zhì)和糖類，也含有豐富的鈣、磷、鐵及維生素等。綠豆中蛋白質(zhì)含量高達(dá)19.5%～33.1%，蛋白質(zhì)功效比高，且氨基酸種類齊全，尤其以賴氨酸含量較為豐富，接近雞蛋蛋白質(zhì)賴氨酸含量[2]。另外，綠豆蛋白具有優(yōu)良的溶解性、保水性、乳化性、凝膠性、發(fā)泡性和泡沫穩(wěn)定性等功能特性[3]，在食品加工業(yè)的面制品、肉制品、乳制品和飲料中的應(yīng)用前景十分廣闊。利用分離蛋白制成的蛋白奶、咖啡豆奶、豆奶酪、果汁豆奶等蛋白飲料，不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且品質(zhì)優(yōu)良、味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者的歡迎。目前，大多數(shù)生產(chǎn)廠家都側(cè)重于綠豆淀粉的加工，而忽略了綠豆蛋白的開發(fā)，只是把它作為生產(chǎn)廢料或牲畜飼料，造成綠豆資源浪費(fèi)，增加綠豆淀粉生產(chǎn)成本，使其在價(jià)格競(jìng)爭(zhēng)上更為不利。因此，開發(fā)生產(chǎn)綠豆分離蛋白更具有重要的社會(huì)意義和顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

目前，綠豆分離蛋白的提取研究仍以堿提酸沉法為主，然而，傳統(tǒng)堿提取綠豆分離蛋白不僅效率低，純度低，而且耗時(shí)，生產(chǎn)成本高。近來(lái)，有報(bào)道用酶法提取綠豆分離蛋白，盡管酶法可以提高效率，但酶價(jià)格昂貴，易失活，提取過程較難控制，生產(chǎn)成本也較高。

超聲技術(shù)是一種新型的物理提取方法。超聲波能夠產(chǎn)生增溶作用而被廣泛應(yīng)用于目的物質(zhì)的強(qiáng)化提取，具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易、提取效率高和提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，已有應(yīng)用超聲提取大豆蛋白、棉籽蛋白、玉米蛋白以及小麥蛋白的報(bào)道，但鮮見超聲提取綠豆分離蛋白的研究。因此，本課題將探討超聲波協(xié)助提取綠豆分離蛋白的最佳提取工藝條件[3]。

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試劑與材料

綠豆：臨綠一號(hào)（十八羅漢），種子公司購(gòu)買。三（羥甲基）氨基甲烷，氯化鈉，鹽酸，牛血清白蛋白，考馬斯亮藍(lán)（G250），85%正磷酸，95%乙醇，石油醚均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器

酸度計(jì)（PHS—3C）、JB-1定時(shí)雙向磁力攪拌器：金壇市榮華儀器制造有限公司；KQ-50型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LG-24A型高速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；電子分析天平（JA1203N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-7504c紫外可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；索氏抽提器：上海貝特儀電設(shè)備廠；微量移液器：北京正興宏業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠豆分離蛋白的提取流程

綠豆分離蛋白的堿提取[1]：綠豆粉→脫脂→浸提→離心分離→上清液蛋白質(zhì)提取率測(cè)定。

綠豆分離蛋白的超聲波法協(xié)助提取[4-6]：綠豆粉→脫脂→超聲波處理→離心分離→上清液蛋白質(zhì)提取率測(cè)定。

1.2.2 綠豆粉的制備

挑揀無(wú)干癟及生蟲的綠豆，放于潔凈的培養(yǎng)盤中，用自來(lái)水沖洗兩三次后，再用蒸餾水洗兩三次。用濾紙吸去多余水分后在室溫下自然風(fēng)干。用粉碎機(jī)將干燥的綠豆粉碎，過篩去除雜質(zhì)。將收集的綠豆粉裝入燒杯中儲(chǔ)存在4℃冰箱中備用。

1.2.3綠豆粉的脫脂——索氏提取器去除油脂[7]

采用索氏提取器去除油脂。

1.2.4 綠豆分離蛋白的堿法提取

準(zhǔn)確稱取4 g脫脂綠豆粉于40℃的60 mL pH 9.0的Tris-HCl緩沖液中，40℃下恒溫?cái)嚢?0 min后，4000 r/min離心15 min，再將離心液用快速濾紙過濾除去漂浮物，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定濾液中的綠豆分離蛋白含量。

1.2.5 超聲波協(xié)助提取綠豆分離蛋白

1.2.5.1 超聲處理時(shí)間對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6份4 g脫脂綠豆粉，分別設(shè)定料液比為1∶15（g/mL），pH 為 9.0，溫度為 40℃，超聲波功率為50 W，超聲處理時(shí)間分別為 10、20﹑30、40﹑50、60 min，將浸提液 4000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.2 溫度對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份4 g脫脂綠豆粉，分別設(shè)定料液比為 1 ∶15（g/mL），pH 為 9.0，溫度分別為 30、35、40﹑45、50℃，超聲波功率為50 W，超聲處理時(shí)間為20 min后，將浸提液 4000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.3 料液比對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份4 g脫脂綠豆粉，分別設(shè)定料液比為 1∶10、1∶15、1 ∶20、1∶25、1 ∶30 g/mL，pH 為 9.0，溫度為45℃，超聲處理時(shí)間為20 min，超聲波功率為50 W，將浸提液 4000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.4 pH對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份4 g脫脂綠豆粉，分別設(shè)定料液比為 1 ∶10（g/mL），pH 分別為 7.6、7.9、8.2、8.5、8.8，溫度為45℃，超聲處理時(shí)間為20 min，超聲波功率為50 W，將浸提液 4000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以便得出綠豆分離蛋白的最佳超聲提取條件。

1.2.6 可溶性綠豆分離蛋白的測(cè)定—考馬斯亮藍(lán)G250染色法

取7支干凈的試管，按表1進(jìn)行編號(hào)并加入試劑。混勻，室溫靜置3 min，以第一管為空白，于波長(zhǎng)595 nm處比色，讀取吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度（μg/mL）作為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度——標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備Table 1 The preparation of protein creational curve

另取一支干凈的試管，加入樣品液2.0 mL及考馬斯亮藍(lán)染液8.0 mL，混勻，室溫靜置3 min，于波長(zhǎng)595 nm處比色，讀取吸光度，由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白質(zhì)含量。

1.2.7 綠豆分離蛋白提取率計(jì)算[8]

測(cè)定總提取液中的水溶性蛋白含量及原料蛋白質(zhì)含量——考馬斯亮藍(lán)法。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)Bradford法制得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of ox blood albumen

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：y=0. 0825+0. 00834x（R=0. 99438）。

2.2 超聲波提取綠豆分離蛋白單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 超聲處理時(shí)間對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響

超聲處理時(shí)間對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the extracting ratio of protein

由圖2可知，超聲處理時(shí)間為10 min～20 min內(nèi)，隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率不斷增加，超聲波處理20 min時(shí)提取率最高。這可能是由于在這段時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，形成的氣泡越多，高頻振蕩越劇烈，吸收的聲能越大，破壁的效果越好，蛋白質(zhì)溶出也越多。而超過20 min后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率反而不斷下降，這可能是由于超聲波的強(qiáng)烈振動(dòng)及熱效應(yīng)作用導(dǎo)致蛋白變性，從而使蛋白水溶性變差。

2.2.2 溫度對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響

溫度對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 The effect of temperature on the extracting ratio of protein

由圖3可知，在35℃～45℃之間，隨著溫度的升高，提取率不斷上升，在45℃達(dá)到最高，所以實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)選提取溫度是45℃。原因是溫度升高至一定程度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)分子展開后，由于疏水基的暴露和蛋白質(zhì)分子相互纏繞而使溶解度降低。

2.2.3 料液比對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響

料液比對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)提取率的影響Fig.4 The effect of the ratio of water on the extracting ratio of protein

由圖4可知，提取率在 1∶10（g/mL）達(dá)到最高，所以實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)選提取料液比為1∶10（g/mL）。隨著料液比的減小，提取率不斷下降。這是由于液體量的增加使蛋白質(zhì)最大限度的溶解，高料液比使得提取液的蛋白質(zhì)濃度太低，從而降低了蛋白提取率。

2.2.4 pH對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響

pH對(duì)綠豆分離蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 The effect of pH on the extracting ratio of protein

由圖5可知，蛋白質(zhì)的提取率隨提取液pH的升高而提高，在pH為8.5時(shí)提取率最高，所以實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)選提取pH為8.5，之后提取液pH繼續(xù)增大提取率反而下降。這是由于堿性過強(qiáng)易造成蛋白質(zhì)的變性，使蛋白的水溶性變差。

2.3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 正交試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)[9]

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，在超聲波功率為50 W的條件下，以超聲-堿提法的提取溫度、超聲提取時(shí)間、提取液pH、料液比為考察因素，各因素取三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，不考慮各因素間的交互影響，以綠豆分離蛋白的提取率為考察指標(biāo)，篩選最佳提取條件，因素-水平設(shè)計(jì)見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 超聲波處理正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test onultrasonics treatment

表3 超聲波提取正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 3 Results of orthogonal test on supersonic extraction

通過由表3極差分析結(jié)果可知，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，超聲波協(xié)助提取綠豆粉粒蛋白的最佳條件為：超聲提取時(shí)間 25 min、提取溫度 45℃、料液比 1∶12（g/mL）、溶液pH8.5。各因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響大小的次序?yàn)镃﹥A﹥B﹥D，即：料液比﹥超聲提取時(shí)間﹥提取溫度﹥pH。

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

進(jìn)行超聲波輔助堿液提取的驗(yàn)證試驗(yàn)3次，測(cè)得蛋白質(zhì)提取率為95.1%。與正交試驗(yàn)最高提取率94.2%相比，提高了0.9%。

2.4 超聲波法與傳統(tǒng)方法的比較

超聲波法與傳統(tǒng)方法的比較見表4。

表4 超聲波法與傳統(tǒng)方法的比較Table 4 Ultrasonic contrast with traditional methods

通過表4的比較可以看出，超聲波輔助堿液提取與單純堿液提取法相比，蛋白提取率提高10.08%。超聲處理使提取時(shí)間縮短了15 min，超聲波法所用料液比增大。因此，采用超聲波輔助堿液提取可以提高綠豆分離蛋白的提取率和提取速率，提高了效率，節(jié)省了成本。

3 結(jié)論

1）以脫脂綠豆粉為原料，采用超聲波輔助堿液提取法提取綠豆分離蛋白，通過單因素和正交試驗(yàn)，得出最適提取條件為：超聲波時(shí)間為25 min、溫度為45 ℃、料液比為 1∶12（g/mL）、溶液 pH8.5，蛋白質(zhì)的提取率為95.1%。

2）采用超聲波輔助堿液提取可以提高綠豆分離蛋白的提取率和提取速率。與單純堿液提取法相比，提取率提高了10.08%。超聲處理使提取時(shí)間縮短了15 min，且料液比降低，大大提高了效率，節(jié)省了成本。

3）探索新的提取工藝技術(shù)，提高提取效率和工業(yè)化實(shí)施的可行性尤為重要。超聲波協(xié)助提取作為一種有效提取方法，具有簡(jiǎn)單、方便、快速和安全等優(yōu)點(diǎn)，在生物的有效成分提取中得到了廣泛應(yīng)用。

4）超聲技術(shù)在協(xié)助提取中有廣闊的應(yīng)用前景，進(jìn)一步開展該技術(shù)的研究，使超聲技術(shù)向有利于工業(yè)化大生產(chǎn)的方向發(fā)展，具有理論意義和實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。超聲波與傳統(tǒng)方法可以很好地結(jié)合起來(lái)，只是在步驟中加入超聲波處理程序。

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