陳宏碩，李曉穎，馮鵬棉，柏松，高建勝

（1.河北聯(lián)合大學(xué)電氣工程學(xué)院，河北唐山063009；2.河北聯(lián)合大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063009；3.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院，河北唐山063009）

螺旋藻是一種微藻類古老生物，屬于藍(lán)藻門，顫藻科。螺旋藻不僅營養(yǎng)價值很高，且其含有的大量生物活性物質(zhì)對人體非常有益，其中最引人注目的是螺旋藻多糖。螺旋藻多糖是從螺旋藻藻體、螺旋藻培養(yǎng)液中提取分離出來的水溶性多糖，是一類具有促進(jìn)細(xì)胞生長、抗輻射、抗衰老、降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成等功能的天然生物活性物質(zhì)[1-3]。尤其近年來研究報道螺旋藻多糖具有良好的抗腫瘤作用，并且它還是天然化合物，具有無毒、高效的特點(diǎn)。

因此，對于研究其抗腫瘤作用及機(jī)制變得越來越重要。本文就螺旋藻多糖抗小鼠H22腫瘤作用進(jìn)行初步研究，旨在探討螺旋藻多糖其抗腫瘤作用及機(jī)制，從而為進(jìn)一步研究開發(fā)螺旋藻多糖藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 螺旋藻

食用螺旋藻粉購自山東東營康瑞科技開發(fā)有限責(zé)任公司，符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16919-1997。

1.2 細(xì)胞株

H22肝癌細(xì)胞購自上海研晶試劑公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

BALB/c小鼠，6～8 周，體重 20 g～22 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.4 儀器

R-1001-L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城儀器有限公司；BCM-1000A型生物潔凈工作臺：南京庚辰科學(xué)儀器公司；Forma 3110系列水套CO2培養(yǎng)箱：上海創(chuàng)迅醫(yī)療器械有限公司；XSZ-H型生物顯微鏡：重慶光電儀器有限公司；MK3全自動酶標(biāo)儀：北京華運(yùn)安特科技有限公司等。

1.5 螺旋藻多糖提取

螺旋藻粉→配成12%的藻粉溶液→加入胰蛋白酶水解→加入木瓜蛋白酶水解→真空濃縮→酒精沉淀→丙酮洗滌→冷凍干燥→多糖粗制品→柱層析→透析→得多糖精品。

1.6 模型制備及分組

動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，取健康的小鼠60只（雌雄各半），稱重后隨機(jī)分為3組：空白對照組、模型組、給藥組。取接種7d的種鼠腹水H22細(xì)胞，用生理鹽水制成細(xì)胞數(shù)為2×106個/mL的細(xì)胞懸液，以每鼠0.2 mL接種于模型組和給藥組小鼠右前肢腋窩皮下[4]。接種24 h后開始給藥，給藥組以 1000 mg/kg/d灌胃，空白對照組、模型組用等量生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d，觀察多糖的抑瘤作用

1.7 螺旋藻多糖抗H22腫瘤作用

1.7.1 臟器指數(shù)和抑瘤率的測定

連續(xù)給藥14 d后，摘取瘤塊、胸腺、脾，按所列公式方法計算抑瘤率、胸腺指數(shù)。

抑瘤率（%）=[1-平均給藥組瘤重（g）/平均模型組瘤重（g）]×100%

胸腺指數(shù)=胸腺重（mg）/體重（g）

脾指數(shù)=脾重（mg）/體重（g）

1.7.2 脾細(xì)胞增殖能力的測定

制備濃度為5×106個/mL的脾細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)孔分兩組分別加ConA（終濃度 10 μg/mL）和 LPS（終濃度 5 μg/mL），對照孔加培養(yǎng)液100 μL，均設(shè)3個復(fù)孔，于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h后，離心棄去上清，每孔加入100 μL MTT（終濃度5μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清。每孔加DMSO 150 μL，溶解Fomazan顆粒，充分震蕩后靜置20 min，酶標(biāo)儀570 nm波長下讀數(shù)，按下列公式計算出其刺激指數(shù)（SI）。

刺激指數(shù)=實(shí)驗(yàn)孔OD570-630值/對照孔OD570-630值

1.7.3 NK細(xì)胞殺傷能力的測定

制得脾細(xì)胞懸液1×107個/mL作為效應(yīng)細(xì)胞，取對數(shù)期H22肝癌細(xì)胞制成5×105個/mL為靶細(xì)胞，各組均設(shè)六個復(fù)孔，效應(yīng)孔每孔加效應(yīng)細(xì)胞100 μL，培養(yǎng)液100 μL，效靶孔每孔加效應(yīng)細(xì)胞100LμL，靶細(xì)胞100 μL，單設(shè)一組靶細(xì)胞孔，每孔加靶細(xì)胞 100 μL，37℃培養(yǎng)4 h后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定其吸光度值，求出各組平均值以殺傷百分率表示NK細(xì)胞活性。

NK細(xì)胞活性（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)孔OD值）/靶細(xì)胞對照孔OD值]×100%

1.7.4 吞噬細(xì)胞吞噬中性紅能力測定

制備濃度為1.8×106個/mL的腹腔細(xì)胞懸液，96孔板中各加100 μL，每組6個復(fù)孔，于37℃培養(yǎng)2 h～5 h，棄上清，每孔加入0.073%的中性紅溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，棄去中性紅，用預(yù)冷的PBS洗2次，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解劑（ 1000 mmol/L醋酸∶無水乙醇=1∶1，體積比），混勻在酶標(biāo)儀上540 nm處測吸光度值。

1.7.5 小鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）含量的測定

連續(xù)給藥14 d后，空白對照組、模型組、給藥組分別小鼠眼球取血，靜置30 min，2500 r/min離心10 min以分離血清，-20℃保存。ELISA法檢測血清中TNF-α、IFN-γ含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用x±s表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用雙樣本等方差假設(shè)的t檢驗(yàn)法，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 小鼠臟器指數(shù)及抑瘤率的測定結(jié)果

小鼠臟器指數(shù)及抑瘤率的測定結(jié)果見表1。

表1 臟器指數(shù)及抑瘤率的測定結(jié)果（±s，n=20）Table 1 The experimental results of organ index and antitumor rate（±s，n=20）

表1 臟器指數(shù)及抑瘤率的測定結(jié)果（±s，n=20）Table 1 The experimental results of organ index and antitumor rate（±s，n=20）

注：△P＜0.05，△△P＜0.01vs空白組；*P＜0.05，**P＜0.01vs模型組。

分組 脾指數(shù) 胸腺指數(shù) 腫瘤/g 抑瘤率/%空白組模型組給藥組5.32±0. 114.53±0.09△5.09±0.12*2.87±0. 071.59±0.11△△2.49±0.15**—2.65±0. 210.63±0.12**— 074.53%

由表1可見，與空白組相比，模型組脾指數(shù)有明顯差異（P＜0.05），胸腺指數(shù)有明顯差異（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組脾指數(shù)有明顯差異（P＜0.05），給藥組胸腺指數(shù)有明顯差異（P＜0.01）。這就說明螺旋藻多糖對小鼠免疫器官起到了一定的保護(hù)作用。與模型組相比，給藥組瘤重顯著降低，差異顯著（**P＜0.01），且抑瘤率達(dá)74.53%，而根據(jù)國家藥監(jiān)局新藥特藥評審規(guī)定，抑瘤率達(dá)30%以上，就算作有效即可作為新藥開發(fā)。綜上，螺旋藻多糖在一定程度上能夠明顯抑制腫瘤生長。

2.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的測定結(jié)果

小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的測定結(jié)果見表2。

表2 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=20）Table 2 The experimental results of Lymphocyte proliferation（±s，n=20）

表2 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=20）Table 2 The experimental results of Lymphocyte proliferation（±s，n=20）

注：**P＜0.01vs模型組。

分組 T細(xì)胞刺激指數(shù) B細(xì)胞刺激指數(shù)空白組模型組給藥組4.39±0. 232.27±0. 133.74±0.31**4.27±0. 362.11±0. 143.58±0.29**

從表2中得出，與模型組相比，T淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)有顯著升高 （P＜0.01），B淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)亦有顯著升高（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠的T細(xì)胞和B細(xì)胞的刺激指數(shù)均有明顯改善，螺旋藻多糖是一種免疫細(xì)胞激活劑，有提高免疫力的作用。

2.3 小鼠脾NK細(xì)胞活性的測定結(jié)果

小鼠脾NK細(xì)胞活性的測定結(jié)果見表3。

表 3 NK 細(xì)胞殺傷活性（±s，n=20）Table 3 Kill rate of NK cells（±s，n=20）

表 3 NK 細(xì)胞殺傷活性（±s，n=20）Table 3 Kill rate of NK cells（±s，n=20）

注：△P＜0.05，△△P＜0.01vs空白組；*P＜0.05，**P＜0.01vs模型組。

分組 NK細(xì)胞殺傷率/%空白組模型組給藥組56.19±2. 1333.27±3. 2750.53±4.04**

從表3中得出，與模型組相比顯著性差異（P＜0.01），給藥組小鼠的NK細(xì)胞殺傷率達(dá)到50.53%，說明給藥組小鼠NK細(xì)胞殺傷活性得到有效恢復(fù)。與空白組相比，給藥組小鼠NK細(xì)胞殺傷率無顯著性差異（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，螺旋藻多糖可能具有激活NK細(xì)胞的活性及抑制NK細(xì)胞凋亡的能力。

2.4 巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的測定結(jié)果

巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的測定結(jié)果見表4。

表4 巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力（±s，n=20）Table 4 Phagocytic index of Neutral Red（±s，n=20）

表4 巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力（±s，n=20）Table 4 Phagocytic index of Neutral Red（±s，n=20）

注：△△P＜0.01vs空白組；**P＜0.01vs模型組。

分組 OD空白組模型組給藥組0.59±0. 030.25±0.01△△0.47±0.03**

從表4中得出，與空白組相比，模型組的吞噬能力明顯下降，呈顯著性差異（P＜0.01）。而給藥組小鼠巨噬細(xì)胞的活性卻得到恢復(fù)，與空白組相比無顯著性差異（P＞0.05），與模型組相比呈顯著性差異（P＜0.01）。這說明螺旋藻多糖能夠有效改善巨噬細(xì)胞的活性，從而提高由巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫能力。

2.5 小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量的測定結(jié)果

小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量的測定結(jié)果見表5。

表5 小鼠血清中TNF-α和IFN-γ含量（±s，n=20）Table 5 The concentrations of TNF-α and IFN-γ in mice blood serum（±s，n=20）

表5 小鼠血清中TNF-α和IFN-γ含量（±s，n=20）Table 5 The concentrations of TNF-α and IFN-γ in mice blood serum（±s，n=20）

注：△P＜0.05，△△P＜0.01vs空白組；*P＜0.05，**P＜0.01vs模型組。

分組TNF-α/（pg/mL）IFN-γ/（pg/mL）空白組 30.23±1. 7645.52±2.85模型組 21.19±1.33△△ 30.98±2.37△△給藥組 36.19±2.04* 53.52±3.76*

從表5看出，與空白組相比，模型組血清中TNF-α、IFN-γ 含量均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組血清中TNF-α、IFN-γ含量均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。這說明螺旋藻多糖在一定程度上能夠升高TNF-α、IFN-γ在血清中的濃度，從而發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。

3 結(jié)論與討論

科學(xué)研究表明藻類中所含有的天然活性植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性、抗腫瘤、毒副作用小的優(yōu)勢，且藥物質(zhì)量通過化學(xué)手段容易控制，故藻類多糖藥物的開發(fā)及利用變得越來越重要。

本實(shí)驗(yàn)以 1000 mg/kg/d螺旋藻多糖給小鼠灌胃，抑瘤率可達(dá)到74.53%，抑制腫瘤效果良好，這充分說明螺旋藻多糖在抗H22腫瘤方面起到了重要作用。

胸腺和脾臟是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，其中胸腺是是T細(xì)胞發(fā)育、分化和成熟的場所，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用；而脾臟是各類免疫細(xì)胞居住和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場所，也是合成免疫活性物質(zhì)（如干擾素、補(bǔ)體、細(xì)胞因子等）的重要場所。因此，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)能夠反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，可作為評價機(jī)體的免疫狀態(tài)的客觀指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠的胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞受到腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)而逐漸凋亡，導(dǎo)致胸腺、脾明顯萎縮。螺旋藻多糖能顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)與脾指數(shù)，與模型組相比，脾指數(shù)升高呈顯著性差異（P＜0.05），胸腺指數(shù)升高也呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），這說明螺旋藻多糖對免疫系統(tǒng)起到了保護(hù)和促進(jìn)恢復(fù)作用。

NK細(xì)胞的免疫反應(yīng)在宿主抗腫瘤和抗感染防御機(jī)制中扮演著重要角色。NK細(xì)胞是細(xì)胞免疫的非特異性成分，不需預(yù)先活化即可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是一類在腫瘤發(fā)生的免疫反應(yīng)中起重要作用的效應(yīng)細(xì)胞，處于機(jī)體抗腫瘤的第一道防線。它的活性受免疫因子調(diào)節(jié)，可引起一系列免疫應(yīng)答[6，7]。因此，NK細(xì)胞殺傷活性的高低也是判斷機(jī)體免疫功能尤其是細(xì)胞免疫功能大小的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，螺旋藻多糖能顯著提高NK細(xì)胞的殺傷活性，與模型組相比，給藥組的NK細(xì)胞殺傷活性提高并呈顯著性差異（P＜0.01）。另外，巨噬細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤免疫中的重要效應(yīng)細(xì)胞，其抗腫瘤作用的最大特點(diǎn)是對腫瘤細(xì)胞的殺傷沒有選擇性，因而巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，給藥組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著提高（P＜0.01）。以上說明螺旋藻多糖可增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫功能，能促進(jìn)H22荷瘤小鼠非特異性免疫功能。

TNF-α是由活化的巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞和NK細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子有介導(dǎo)炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。TNF-α對腫瘤細(xì)胞具有直接的殺傷和誘導(dǎo)凋亡作用[5-9]。TNF-α抗腫瘤具有高選擇性殺傷功能，僅僅對腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性作用，而不損傷正常細(xì)胞。IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cel）所分泌，并以多種方式參與影響免疫應(yīng)答，是體內(nèi)作用最強(qiáng)的炎癥介質(zhì)之一，其生物學(xué)作用非常廣泛，能通過多種機(jī)制激發(fā)炎癥反應(yīng)，在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。IFN-γ抑制腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制主要有以下幾方面[10-12]：（1）能有效抗腫瘤內(nèi)血管生成，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；（2）對惡性腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用；（3）干擾素能抑制腫瘤細(xì)胞增生，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；（4）能夠?qū)Π┗蜻M(jìn)行調(diào)控，從而抑制癌基因的表達(dá)；（5）通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，螺旋藻多糖給藥組顯著提高了血清中TNF-α和IFN-γ的含量，增強(qiáng)了機(jī)體抗腫瘤的能力，且與模型組相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

綜上所述，螺旋藻多糖具有良好的免疫增強(qiáng)活性，對H22腫瘤有抑制作用，提高了H22荷瘤小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)、NK細(xì)胞殺傷活性及巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加了血清中TNF-α和IFN-γ的含量。從而顯著提高機(jī)體免疫力，起到抑制腫瘤細(xì)胞的生長的作用。

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