趙玉英，吳志剛，王二兵

（太原科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，山西太原030021）

茯苓（Poria Cocos）是我國的傳統(tǒng)名貴、藥食兩用中藥材。為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，別稱松茯苓、松柏芋、茯菟等，有寧心安神、抑菌殺菌、降血糖、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫力、誘生與促干擾素和白細(xì)胞調(diào)節(jié)素等作用，對人體有較高的保健功能和藥用價(jià)值[1-2]。作為茯苓最有效成分之一的茯苓多糖更見長于提高人體免疫機(jī)能、防治腫瘤、抗炎等生物學(xué)活性。但傳統(tǒng)的茯苓多糖提取方法耗時(shí)長，而且提取率較低。目前，超聲技術(shù)在植物多糖的提取中已越來越引起人們的重視，超聲提取方法具有高回收率、加熱快速、控溫容易等優(yōu)點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)分別采用正交設(shè)計(jì)對茯苓多糖的索氏回流提取和均勻?qū)嶒?yàn)對茯苓多糖的超聲波提取進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，并對比最佳工藝提取的茯苓多糖的多糖含量、蛋白質(zhì)及紅外光譜進(jìn)行比較研究，以期篩選出一種高效、經(jīng)濟(jì)的提取方法，為茯苓的實(shí)際生產(chǎn)提供理論參考。

1 儀器與材料

1.1 藥材

茯苓（萬生中藥廠，批號：11120產(chǎn)地：安徽）。

1.2 儀器

SC202型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：浙江嘉興縣新勝電熱儀器制造廠；FW80微型高速萬能試樣粉碎機(jī)、HH-2型電熱恒溫水浴鍋、101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、MH-250調(diào)溫型電熱套：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HairBCD-215KA DZ型電冰箱：青島海爾股份有限公司；FA1204B型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；60目標(biāo)準(zhǔn)篩：浙江上虞金鼎標(biāo)準(zhǔn)篩廠；WKY型微量移液器：上海求精生化試劑儀器有限公司；LD5-10型低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；VIS-723G型可見-紫外分光光度計(jì)：北京瑞科分析儀器公司；THC-5B超聲波提取機(jī)：濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；紅外光譜儀：北京東訊天地醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 試劑

95%乙醇、葡萄糖、三氯甲烷、苯酚、丙酮、正丁醇、濃硫酸、無水乙醇，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 茯苓多糖的提取

原料→烘干（48±2℃下恒溫干燥48 h）→粉碎（過60目篩）→稱樣→配比→回流﹙脫單糖﹚→索氏提取﹙脫脂﹚→提取多糖→Sevag除蛋白→水層離心→取上清液→濃縮→放置冰箱→棄上清液→揮干→殘?jiān)銣馗稍铩密蜍咚苄远嗵菢悠贰鷾y吸光度→記錄數(shù)據(jù)→計(jì)算多糖含量

2.2 茯苓的預(yù)處理

將茯苓藥材在（48±2）℃下恒溫干燥48 h，趁熱粉碎過60目篩。取上述粉末20 g，分別加入80%乙醇90 mL回流提取1 h，棄去上清液，殘?jiān)屑尤?0%乙醇90 mL，回流提取1 h，揮干，在殘?jiān)屑尤?0%乙醇90 mL，靜置12 h，棄去上清液，在殘?jiān)性偌尤?0%乙醇90 mL，索氏提取2 h，將殘?jiān)稍铮密蜍邩悠贩勰?，稱重。

2.3 茯苓多糖的純化

在提取的茯苓多糖液體中加入三氯甲烷：正丁醇（5 ∶1）60 mL，振搖 30 min，靜置過夜，棄去有機(jī)層，水層以 3000 r/min離心10 min；取上清液濃縮至約15 mL左右，加入95%乙醇使溶液含醇量達(dá)85%，放置冰箱過夜，棄去上清液，揮去乙醇，殘?jiān)?0℃下恒溫干燥，即得茯苓水溶性多糖樣品。

2.4 多糖含量的測定

本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量的計(jì)算。

2.4.1 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的無水葡萄糖15.3 mg，加適量水溶解，定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。

2.4.2 供試品溶液的制備

精密稱取各樣品粉末約0. 0125 g，取適量水溶解，定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，搖勻備用。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、100、120、140、160、180 μL置于具塞試管中，依次加入蒸餾水2.00、1.90、1.88、1.86、1.84、1.82 mL，5%苯酚溶液 1.0 mL，濃硫酸7.0 mL，搖勻備用。將上述具塞試管于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻5 min，再放入冷水浴中15 min，取出，于486 nm，在此波長下測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度（A）。以吸光度A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，得到葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)線方程：A=0.040C-0.034（r=0.999），結(jié)果表明葡萄糖在 6.0 μg/mL～10.8 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 樣品中多糖的測定。

取各樣品溶液100 μL于具塞試管中，依次加入1.9 mL蒸餾水，1.0 mL苯酚，7.0 mL濃硫酸，搖勻。將上述具塞試管于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻5 min，再放入冷水浴中15 min，取出，在486 nm處測定各樣品溶液的吸光度值，計(jì)算多糖含量。

2.5 茯苓多糖的索氏回流提取法

選擇固液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素[4]，以多糖含量為考察指標(biāo)，選擇L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平安排見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test table

2.6 茯苓多糖的超聲波提取法

選擇提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率和固液比四個(gè)因素[5]，以多糖含量為考察指標(biāo)，選擇均勻設(shè)計(jì)表中的U64進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平安排見表2。

表2 均勻?qū)嶒?yàn)因素水平表Table 2 Uniform experiment test table

2.7 茯苓多糖的紅外分析方法

精密稱取樣品1 mg，光譜純、干燥的KBr粉末200 mg，在瑪瑙乳缽中研細(xì)、混勻，壓片制樣品。測定條件為：光譜范圍為 4000cm-1～400cm-1，分辨率為 4cm-1，掃描次數(shù)為16次。結(jié)果采用GRAMS/32AI軟件進(jìn)行分析。

2.8 茯苓多糖的紫外分析方法

取茯苓多糖加水溶解，配制成濃度為0.08 g/L的多糖水溶液，在200 nm～400 nm波長范圍內(nèi)，使用紫外分光光度計(jì)對多糖溶液進(jìn)行紫外掃描，分析多糖溶液的吸收情況，以判斷有無核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰。

3 結(jié)果

3.1 茯苓多糖含量的測定的方法學(xué)考察

3.1.1 精密度試驗(yàn)

精密量取對照品溶液0.8 mL于具塞試管中，測定A值，重復(fù)測定6次，結(jié)果A值的RSD為0.091%。

3.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取供試品溶液100 μL于具塞試管中，測定A值，每隔30 min測定1次，結(jié)果A值的RSD為0.907%，表明供試品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

制備供試品溶液，平行6份，各精密量取100 μL于具塞試管中，測定A值，計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.636%。

3.1.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取樣品溶液50μL，平行6份，均加入50μL的對照品溶液，測定A值，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.68%，RSD為1.893%。

3.2 茯苓多糖的索氏回流提取法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固液比和提取次數(shù)對提取收率的影響顯著，而提取時(shí)間影響較小。比較R值的大小可以看出，各因素的影響順序?yàn)椋汗桃罕龋咎崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間；比較K值可以看出，傳統(tǒng)法對茯苓多糖的提取最佳條件為：固液比1∶60，提取次數(shù)4，提取時(shí)間5h，多糖提取率為1.247%。從表4得知A因素固液比在α=0.10水平具有顯著性，其他因素?zé)o顯著性。

表3 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表Table 3 Orthogonal test results and variance analysis

表4 方差分析表Table 4 The Variance analysis

3.3 茯苓多糖的超聲波提取法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用均勻設(shè)計(jì)所得超聲波法提取茯苓多糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。直觀分析表明3號多糖含量最高，故選取3號為多糖較適宜的提取條件，即超聲波功率400W，提取時(shí)間60 min，固液比1∶40，提取溫度為45℃。

3.4 兩種提取法提取的茯苓多糖比較研究

1）兩種提取法提取的茯苓多糖含量的比較。對兩種提取方法的最佳提取工藝所得茯苓多糖含量進(jìn)行對比，如圖1-A，可知，無論是超聲波提取，還是傳統(tǒng)提取，多糖含量無顯著性差異，這說明兩種方法在提取多糖上差不多。但相比而言超聲波提取迅速、方法簡便。

表5 超聲波提取茯苓多糖含量Table 5 Content of poria cocos polysaccharide by ultrasonic extraction

2）兩種提取法提取的茯苓多糖中蛋白質(zhì)分析。如圖1-B，在200 nm～400 nm的波長范圍內(nèi)對茯苓多糖進(jìn)行紫外掃描，光譜顯示茯苓多糖具有多糖特征性的紫外吸收圖譜。多糖在200 nm處均有強(qiáng)多糖吸收峰，大于250 nm無明顯的紫外吸收。蛋白質(zhì)特征吸收峰在280 nm，核酸在260 nm附近，多糖在260 nm及280 nm處無明顯的特征吸收峰。結(jié)果表明，茯苓多糖中不含核酸、蛋白質(zhì)。

圖1 兩種提取法所得茯苓多糖比較Fig.1 Comparation of poria cocos polysaccharide by two extraction method

3）兩種提取法提取的茯苓多糖的FTIR分析。

圖2 兩種提取法所得茯苓多糖的紅外圖譜Fig.2 The FTIR spectrums of poria cocos polysaccharide by two extraction method

從圖2中可以看出，兩種提取方法所得水溶性茯苓多糖的紅外吸收譜型基本相同，在 3383.9 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)寬峰，是O-H的伸縮振動(dòng)，是表示在多糖間存在分子內(nèi)和分子間氫鍵；在 2800 cm-1～3000 cm-1范圍的吸收峰是糖類的特征峰，茯苓多糖有在2934.2cm-1處的吸收峰，是由多糖分子的C-H伸縮振動(dòng)引起的。 1429.1 cm-1是羧基的C-O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，1368.3 cm-1處弱的吸收峰為C-H的變角運(yùn)動(dòng)引起的，762.74 cm-1處是D-葡萄吡喃糖環(huán)C-O-C的振動(dòng)吸收峰，1044 cm-1～1079 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是常見的吡喃糖環(huán)內(nèi)酯和羥基的共振吸收峰，是由C-O-C醚鍵的不對稱伸縮振動(dòng)引起的，是糖類的特征吸收峰，也是葡萄糖的紅外光譜信號。不同的是，二者確定吸收峰處的峰形（高度和寬度）略有差異，這可能是由于水溶性茯苓多糖超分子結(jié)構(gòu)體系中的分子內(nèi)和分子間氫鍵發(fā)生變化所導(dǎo)致。

4 結(jié)論

超聲波提取法與索氏回流提取法所提取的茯苓多糖量相差無幾，相比而言超聲波處理能夠破壞茯苓細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促使多糖更多更快地轉(zhuǎn)移至提取溶劑中，從而提高提取效率，故超聲波提取迅速、方法簡便易行。

[1] 陳春霞.茯苓多糖體的藥理藥化研究及其臨床應(yīng)用的初探[J].中草藥,1985,16(4)：40-44

[2] 孫元琳,楊萍芳,吳海霞,等.水法提取當(dāng)歸多糖工藝條件優(yōu)化[J].中國食品學(xué)報(bào),2009,9(5)：130-134

[3] 張穎.對茯苓多糖提取方法的比較研究[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2012,2(4)：249-250

[4] 霍文,孫廣利,劉鵬.正交試驗(yàn)法優(yōu)選茯苓多糖提取工藝[J].西北藥學(xué)雜志,2006,2(1)：18-19

[5] 趙子劍,陳迪釗,連琰,等.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化超聲波提取茯苓多糖工藝條件的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2009,20(2)：325-326