孫 健，尹 丹，毛 君，陳 瑛(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院產(chǎn)科，蘇州 500;南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院新生兒科;通訊作者，E-mail:cyandzh@sohu.com)

Gilbert綜合征(Gilbert syndrome)是血液中非結(jié)合膽紅素顯著增高而發(fā)生黃疸的一類(lèi)良性遺傳性疾?。?］。正常人的膽紅素經(jīng)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生后與白蛋白結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)到肝細(xì)胞表面后被肝細(xì)胞攝取、內(nèi)化固定并轉(zhuǎn)運(yùn)到肝微粒體，在膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTA1)作用下，一個(gè)或兩個(gè)葡萄糖醛酸基結(jié)合到膽紅素分子側(cè)鏈上，生成兩種結(jié)合膽紅素，即膽紅素單葡萄糖醛酸酯和膽紅素二葡萄糖醛酸酯，并排泌到膽道系統(tǒng)中［2］。

膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT1A1)是肝臟結(jié)合膽紅素的關(guān)鍵酶，在催化和排泄膽紅素過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用，UGT1A1基因異常可導(dǎo)致肝臟微粒體的膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下降，從而引起膽紅素代謝障礙。國(guó)外報(bào)道UGT1A1基因有很多突變型，在高加索人和非洲人中，在UGT1A1的啟動(dòng)子TATA盒中一般有 TA插入，使正常 A(TA)6TAA突變?yōu)锳(TA)7TAA［3］，在亞洲人中，變異更多發(fā)生在編碼區(qū)，該變異有的為純合性，而有的為雜合性。因此該疾病的遺傳特征是常染色體隱性遺傳還是常染色體顯性遺傳還存在爭(zhēng)議［4，5］。國(guó)外報(bào)道其發(fā)病率為3%-10%［6］。本研究對(duì)1例Gilbert綜合征患者及其家系進(jìn)行致病基因突變位點(diǎn)檢測(cè)，明確該家系的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 樣本來(lái)源

先證者(Ⅲ1)，女，28歲，體檢發(fā)現(xiàn)總膽紅素升高至49.1 μmol/L，直接膽紅素和間接膽紅素都偏高，谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等肝功能指標(biāo)正常，查肝、膽、胰、脾B超未見(jiàn)異常，查血常規(guī)示血紅蛋白122 g/L，其余血常規(guī)指標(biāo)基本正常，查網(wǎng)織紅細(xì)胞示0.059 8，基本排除血液科溶血性疾病。

家系調(diào)查(見(jiàn)圖1):家族4代，共4人有癥狀，先證者(Ⅲ1);先證者外公(Ⅰ1)有皮膚鞏膜黃染，但是外公拒絕抽血化驗(yàn)血生化全套;先證者之姨(Ⅱ5)也有皮膚鞏膜黃染情況，總膽紅素偏高;先證者之女(Ⅳ1)出生第2天溶血性黃疸，總膽紅素嚴(yán)重偏高，2周歲總膽紅素仍偏高。根據(jù)流行病調(diào)查結(jié)果排除其他疾病，調(diào)查前每位成員都做到知情同意，并與所有采血對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

圖1 患者一家4代家系圖Figure 1 The pedigree of Gilbert syndrome’s family

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

設(shè)計(jì)UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)域TATA盒及5對(duì)外顯子及側(cè)翼部分內(nèi)含子序列，用于鑒定該家系UGT1A1基因突變情況，所設(shè)計(jì)的引物見(jiàn)表1，全部引物均由上海捷瑞生物工程有限公司(Generay)生物技術(shù)有限公司合成，使用濃度均為1 μmol/L。

表1 擴(kuò)增UGT1A1外顯子引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 The prim er sequence for am p lifying the exons of UGT1A1 gene and length of product

1.3 基因組DNA制備及PCR擴(kuò)增

用QIAGEN公司試劑盒提取外周全血基因組DNA，操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)。以基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50-80 ng基因組 DNA，10 × buffer 1.0 μl，上下游引物各 1.0 μl，dNTP(2 mmol/L)1.5 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.0 μl，F(xiàn)AST-Taq 酶(Roche 公司)0.15 μl，補(bǔ)充雙蒸水至10 μl。PCR反應(yīng)在ABI9600熱循環(huán)儀上完成，反應(yīng)條件為touchdown程序，95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，68℃退火50 s，72℃延伸1 min;以后每個(gè)循環(huán)退火溫度依次降低0.5℃，直到63℃，共11個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，63℃退火50 s，72℃延伸1 min，共24個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

1.4 PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序

取3 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收純化特異性片段并使用引物測(cè)序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后分別采用擴(kuò)增用引物進(jìn)行測(cè)序。1號(hào)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物包括基因啟動(dòng)子區(qū)域的TATA盒部分，測(cè)序儀為ABI3130。所有測(cè)序結(jié)果采用FinchTV軟件進(jìn)行綜合分析。

2 結(jié)果

2.1 血清膽紅素水平

該Gilbert綜合征家系成員血清膽紅素水平見(jiàn)表2。先證者(Ⅲ1)及其女兒(Ⅳ1)、姨姨(Ⅱ5)的膽紅素水平均升高。

表2 Gilbert綜合征家系成員血清膽紅素水平(μm ol/L)Table 2 The serum bilirubin level of Gilbert syndrome’s family members(μmol/L)

2.2 PCR 擴(kuò)增

啟動(dòng)子TATA盒與外顯子 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳條帶是目的條帶，并且條帶唯一(見(jiàn)圖2)。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of PCR products

2.3 啟動(dòng)子TATA盒測(cè)序結(jié)果

對(duì)啟動(dòng)子TATA盒序列的掃描結(jié)果顯示該家系UGT1A1基因啟動(dòng)子存在TA插入突變，即由正常的A(TA)6TAA突變?yōu)锳(TA)7TAA。先證者Ⅲ1和Ⅱ5為突變雜合子(見(jiàn)圖3)。

圖3 家系成員UGT1A1基因啟動(dòng)子TATA盒測(cè)序結(jié)果Figure 3 The sequence results of UGT1A1 gene promoter TATA box of family members

2.4 外顯子測(cè)序結(jié)果

Ⅱ5的UGT1A1的1號(hào)外顯子第211位的鳥(niǎo)嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，為雜合突變，導(dǎo)致編碼產(chǎn)物中第71位甘氨酸變?yōu)榫彼?p.G71R)(見(jiàn)圖4)。

圖4 家系成員UGT1A1基因外顯子突變位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果Figure 4 Sequence results of site mutation in exons of UGT1A1 gene of family members

2.5 G71R錯(cuò)義突變位點(diǎn)多物種比較

通過(guò)Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)突變位點(diǎn)(第71位)，進(jìn)行多物種的氨基酸序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)在比較的7種物種中非常保守，第71位均為甘氨酸G(見(jiàn)圖5)，此位點(diǎn)的錯(cuò)義突變?nèi)菀滓鸬鞍踪|(zhì)功能上的改變，從而引起膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的活性下降。

圖5 G71R錯(cuò)義突變位點(diǎn)進(jìn)化上保守性分析Figure 5 Conservation analysis in evolution of G71R missense mutation

3 討論

Gilbert綜合征的發(fā)病原因主要是UGT1A1基因發(fā)生缺陷。UGT1A1基因的突變類(lèi)型較多，且不斷有新的突變類(lèi)型被發(fā)現(xiàn)，血清非結(jié)合膽紅素增高幅度的差異也較大［4，7］。國(guó)內(nèi)報(bào)道的家系也不多，而且UGT1A1基因的突變類(lèi)型也各不一樣［8-12］。

本研究中，先證者Ⅲ1和Ⅱ5存在UGT1A1基因啟動(dòng)子TA插入突變，且均為雜合突變;Ⅱ5還存在編碼區(qū)雜合突變(p.G71R)，而先證者不存在編碼區(qū)突變，這也是Ⅱ5的總膽紅素高于先證者的原因。

UGT1A1基因啟動(dòng)子TATA盒中TA堿基序列插入突變，遺傳方式為常染色體遺傳，但是遺傳特征是常染色體隱性遺傳還是常染色體顯性遺傳還不確定［5］。啟動(dòng)子區(qū)域緊靠第1外顯子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游，包括TATA盒啟動(dòng)序列，TATA盒是轉(zhuǎn)錄因子ⅡD的結(jié)合部位，在轉(zhuǎn)錄起始上起重要作用。如果存在更長(zhǎng)的TATAA原件，會(huì)導(dǎo)致報(bào)告基因的表達(dá)降低［3］，A(TA)7TAA/A(TA)7TAA 和 A(TA)7TAA/A(TA)6TAA雜合的基因型與野生型A(TA)6TAA/A(TA)6TAA相比啟動(dòng)子活性降低，轉(zhuǎn)錄效率下降，UGT1A1基因的表達(dá)能力下降，從而使酶活性減低，導(dǎo)致個(gè)體血清中膽紅素水平增高。日本一項(xiàng)研究分析了患者與正常對(duì)照者的膽紅素水平，結(jié)果顯示基因型為A(TA)7TAA/A(TA)7TAA突變純合子者，平均膽紅素水平分別為 37.7 μmol/L 和 16.2 μmol/L，基因型為A(TA)7TAA/A(TA)6TAA突變純合子者，平均膽紅素水平分別為 30.6 μmol/L 和10.7 μmol/L，正常野生型者平均膽紅素水平分別為19.6 μmol/L 和 9.5 μmol/L［13］。

Koiwai等［14］1995 年報(bào)道了外顯子1 的 p.G71R突變，此位點(diǎn)突變?cè)谌毡救?、韓國(guó)人及我國(guó)人群中最常見(jiàn)［15］。對(duì)p.G71R突變位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)化上保守性分析發(fā)現(xiàn)，此位點(diǎn)在人、大鼠、小鼠、黑猩猩、東非狒狒等物種中非常保守(見(jiàn)圖5)，都為鳥(niǎo)嘌呤(G)，如果突變成腺嘌呤(A)會(huì)導(dǎo)致UGT1A1結(jié)構(gòu)異常，從而發(fā)生基因的功能缺陷。國(guó)內(nèi)宋華等［8］也有此位點(diǎn)突變的報(bào)道。

值得注意的是，UGTlAl基因突變?cè)贕ilbert綜合征發(fā)病過(guò)程中雖起主要作用，但仍不可忽視其他的原因。有些人即使有TATA盒中TA堿基序列插入突變和G71R突變，但膽紅素水平仍維持在正常范圍，可能與體內(nèi)其他基因上調(diào)UGTlAl表達(dá)，彌補(bǔ)該基因突變導(dǎo)致的缺陷有關(guān);Gilbert綜合征也可能與microRNA有關(guān)，最近有研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA491-3p能夠抑制 UGT1A1 的表達(dá)［16］，MicroRNA491-3p 可以作用于UGT1A1的3’UTR區(qū)，并且對(duì)UGT1A1的mRNA水平起抑制作用;還有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生在苯巴比妥反應(yīng)增強(qiáng)元件的c.-3279T＞G突變也會(huì)影響UGT1A1的表達(dá)［17］。這都充分說(shuō)明了Gilbert綜合征發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。

Gilbert綜合征為先天性良性疾病，預(yù)后較好，一般無(wú)需特殊治療，因此早期診斷更有意義，可避免過(guò)度治療給患者及家屬帶來(lái)不必要的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而且通過(guò)對(duì)我國(guó)更多人群UGT1A1基因的檢測(cè)，進(jìn)行基因突變數(shù)據(jù)的積累，對(duì)明確闡述我國(guó)人群Gilbert綜合征的發(fā)病機(jī)制和對(duì)指導(dǎo)黃疸患者的診斷和遺傳咨詢(xún)以及實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥等都具有重要意義。

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