周永莉，牛春燕，高保華，閆 蓉(西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710077)

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，其作用的產(chǎn)物內(nèi)源性脂肪酸是腫瘤細(xì)胞增殖的物質(zhì)和能量來源。研究顯示FAS在許多腫瘤組織中高表達(dá)而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)［1，2］，本項目前期研究［3］顯示，F(xiàn)AS 在食管癌中高表達(dá)，陽性表達(dá)率為95%，而在正常食管組織中不表達(dá)，本研究繼續(xù)選擇FAS為靶點，進(jìn)行RNA干擾研究，探討FAS在食管癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

靶向FAS的雙鏈小干擾 RNA(siRNA)及載體由廣州市銳博生物科技有限公司合成、購買，siRNA序列為5’-TGGAGCGTATCTGTGAGAA-3’。MTT購自美國Sigma公司，F(xiàn)AS抗體和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz Biotech公司。cleaved Caspase-3抗體、cleaved Caspase-8抗體、cleaved Caspase-9抗體及Bcl-2抗體購自德國 Merck Millipore公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 FAS siRNA轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞TE13 將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞TE13用培養(yǎng)基稀釋至2×105cells/ml，接種于6孔板，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞融合度達(dá)70%左右用于轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為3組:野生型(WT)組、陰性對照(NC)組和干擾(KD)組。將50 nmol/L siRNA重組質(zhì)粒和5 μl Lipofectamine 2000分別加入250 μl無血清DMEM中混勻，室溫孵育5 min，然后混勻這兩種液體，室溫孵育20 min，最后將siRNA重組質(zhì)粒-Lipofectamine 2000混合液體加入干擾KD組六孔板細(xì)胞中，混勻。轉(zhuǎn)染37℃孵育培養(yǎng)48 h后檢測FAS的表達(dá)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期細(xì)胞TE13，以2×103/孔接種96孔板，培養(yǎng)24 h，待其貼壁后用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，再用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后開始實驗。實驗分別設(shè)野生型(WT)組、陰性對照(NC)組和干擾(KD)組，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng) 1，2，3，4，5 d后分別加入 5 g/L MTT溶液 20 μl，37 ℃孵育 4 h，棄去培養(yǎng)基，加入 200 μl DMSO，振蕩10 min后經(jīng)酶聯(lián)檢測儀上于570 nm波長處檢測OD值，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測蛋白的表達(dá) 采用Western blot檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，實驗分別設(shè)干擾KD組、對照NC組及WT組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞上清總蛋白，Bradford法測定濃度，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5% 脫脂奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng)檢測蛋白的抗體4℃過夜。次日TBST漂洗3次，加辣根酶標(biāo)記二抗，孵育1 h后，ECL化學(xué)發(fā)光劑于暗室中曝光和顯影。在軟件Quantity One Manual上分析灰度值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 實驗設(shè)干擾KD組、對照NC組。轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化離心收集細(xì)胞，70%乙醇固定置于4℃過夜，離心去除乙醇，PBS洗2次，加終濃度50 mg/L的RNaseA，室溫靜置1 h，PI染色置4℃，30 min，300目尼龍網(wǎng)過濾后，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，并按以下公式計算其增殖指數(shù)(proliferative index，PI):PI=(G2M+S)/(G0/1+S+G2M)×100%。

1.2.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 實驗設(shè)干擾KD組、對照NC組及WT組，轉(zhuǎn)染48 h后，常規(guī)制備細(xì)胞爬片，甲醛固定60 min，雙氧水封閉10 min，TritonX處理5 min，加入TUNEL反應(yīng)液，37℃避光水浴1 h，加入POD后水浴30 min，DAB顯色10 min，蘇木精復(fù)染。結(jié)果 判斷:凋亡細(xì)胞為細(xì)胞核中有綠色熒光者，藍(lán)色熒光者為活細(xì)胞。光鏡下計算細(xì)胞中凋亡的細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗及方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，MTT檢測采用組間方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染FAS-siRNA后細(xì)胞中FAS蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后，與對照NC組及WT組相比，干擾KD組顯著降低了FAS蛋白的表達(dá)水平(見圖1)。

圖1 Western blot檢測FAS蛋白表達(dá)水平在KD、NC、WT組的表達(dá)Figure 1 Western blot analysis of FAS protein in KD，NC and WT cells

2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖情況

MTT分析顯示，轉(zhuǎn)染后，干擾KD組與NC及WT組相比，TE13細(xì)胞增殖明顯減慢，差異有顯著性(P＜0.05，見圖2)。結(jié)果 顯示FAS基因的沉默能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

2.3 FAS-siRNA對TE13細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，干擾KD組與陰性對照NC組相比，G0/G1期細(xì)胞比率升高，S期比率降低，G1期細(xì)胞阻滯，增殖指數(shù)PI顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

圖2 MTT法檢測食管癌細(xì)胞TE13的增殖情況Figure 2 Proliferation of TE13 cells analyzed by MTT

表1 腫瘤細(xì)胞TE13基因干擾組與陰性對照組的細(xì)胞周期比較 (%)Table1 Comparison of cell cycle of TE13 cells in interference group and negative control group (%)

2.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

凋亡結(jié)果顯示，干擾KD組、對照NC、WT組凋亡率分別為(29.51 ±1.24)%、(4.12 ±1.38)% 和(2.23±1.29)%。干擾KD組與對照NC、WT組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見圖3)。

2.5 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后TE13細(xì)胞中Bcl-2及活化的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后，與對照NC組相比，干擾KD組Bcl-2表達(dá)水平明顯降低，cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8及cleaved Caspase-9表達(dá)水平明顯升高(圖4)?；叶确治鲲@示，cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-9及Bcl-2的表達(dá)變化均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

圖3 KD及NC、WT組中腫瘤細(xì)胞TE13的凋亡情況Figure 3 Apoptosis of TE13 cell in KD，NC and WT groups

圖4 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2的蛋白表達(dá)水平Figure 4 Protein levels of Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9 and Bcl-2 by Western blot

3 討論

FAS位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，是一種大分子蛋白復(fù)合物，是內(nèi)源性脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。人的FAS基因位于17q25，由7512個核苷酸編碼2504個氨基酸，兩條肽鏈組成的二聚體。研究顯示FAS作用的產(chǎn)物內(nèi)源性脂肪酸是腫瘤細(xì)胞增殖的物質(zhì)和能量來源，腫瘤細(xì)胞中合成的脂肪酸占所有甘油三酯中脂肪酸的93%，并且不受正常細(xì)胞對脂肪酸合成途徑的調(diào)節(jié)［4］。FAS在大部分正常細(xì)胞和組織中幾乎不表達(dá)，但在許多惡性腫瘤中過表達(dá)，如腎細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤中都有FAS的高度表達(dá)［5-7］，并與腫瘤的惡性表型和較差的臨床預(yù)后密切相關(guān)。因此探討FAS在腫瘤細(xì)胞中的作用具有重要意義。

食管癌是發(fā)生在食道上皮組織的惡性腫瘤，全世界每年約有22萬人死于食道癌，食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。FAS在食管癌中存在過表達(dá)［3］。RNA干擾(RNA interference)技術(shù)因其具有簡單、快速、高效性和特異等特點而成為關(guān)閉特定基因功能的新技術(shù)，為基因功能研究和疾病基因治療提供了新的手段。

本研究利用RNAi特異地抑制食管癌TE13細(xì)胞中FAS基因的表達(dá)后，通過MTT、FCM及TUNEL實驗顯示對FAS的抑制顯著地抑制了食管癌細(xì)胞TE13的增殖，并能夠誘導(dǎo)其凋亡。FAS抑制介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制仍然不清楚。Knowles等［8］在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP，前列腺癌細(xì)胞系PC-3中對FAS進(jìn)行小分子化學(xué)抑制或RNA干擾，研究顯示，F(xiàn)AS的抑制介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡都是通過Caspase-8介導(dǎo)的外源性凋亡途徑，而不是Caspase-9內(nèi)源性凋亡途徑。但是Liu等［9］研究顯示FAS的抑制誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB468的凋亡是通過細(xì)胞的內(nèi)源性凋亡途徑啟動的，主要依據(jù)促凋亡蛋白Bax的上調(diào)和細(xì)胞色素-C的釋放。研究顯示［10］，在惡性黑色素瘤中，F(xiàn)AS的抑制誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡也是通過線粒體內(nèi)源性凋亡途徑來實現(xiàn)的。因此，可能在不同腫瘤細(xì)胞中FAS的抑制介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑不同。

本研究顯示RNAi特異地抑制食管癌TE13細(xì)胞FAS基因表達(dá)后 Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3的活化表達(dá)均上調(diào)，因此TE13細(xì)胞中FAS的抑制介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不但有Caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑參加，也有Caspase-8介導(dǎo)的外源性凋亡途徑參加。

研究表明FAS能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，可能在食管癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，可以為食管癌的診斷及治療提供新的靶向策略。

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