吳 彬，游錦梅，李 鈺，Yang Yong，陳顯久(太原鋼鐵(集團(tuán))有限公司總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，太原 0000;山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室;山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院骨科; Department of Epidemiology，Medical Board，Singapore General Hospital;通訊作者，E-mail:969788@qq.com)

磷酸核糖焦磷酸合成酶2(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2，PRPS2)是編碼體內(nèi)嘌呤、嘧啶兩種核苷酸從頭合成、補(bǔ)救合成的關(guān)鍵酶基因。利用RNAi表達(dá)載體可對(duì)PRPS2基因的表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和生長，有望成為腫瘤治療的新思路。該思路成功應(yīng)用于阻斷血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅳa(N-acetyl glucosaminyl transferaseⅣa，GnTⅣa)等基因的表達(dá)［1，2］。本研究擬通過設(shè)計(jì)靶向PRPS2基因的短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA，shRNA)并重組至GV102真核表達(dá)載體為 shRNA質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞PRPS2表達(dá)的抑制作用，并從中篩選出干擾效果最好的干擾載體，為探討PRPS2表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞行為的影響提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

GV102真核表達(dá)載體購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;IMDM購自Hyclone公司;蛋白裂解液及上樣緩沖液購自武漢博士德生物工程有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自美國promega公司;Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶緩沖液等試劑購自大連TaKaRa公司;PRPS2抗體、β-actin抗體購自英國Abcam公司;Effectene Transfection Reagent購自德國QIAGEN公司。人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞由山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 人PRPS2 shRNA的設(shè)計(jì)與shRNA載體的構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)［3-5］的篩選及設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)PRPS2 shRNA。從NCBI檢索得到人PRPS2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本mRNA序列(NM_001039091.2和 NM_002765.4)。用Invitrogen公司提供的shRNA工具軟件(http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)設(shè) 計(jì) 人PRPS2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本共同序列部分的干擾序列及陰性對(duì)照序列，利用 NCBI的 Blast篩選出 3條與人PRPS2完全匹配，且與人其他基因同源性較低的shRNA序列。shRNA序列由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，將其分別與真核表達(dá)載體GV102重組為shRNA，三條干擾載體分別命名為GV102-PRPS2-1、GV102-PRPS2-2、GV102-PRPS2-3，分別轉(zhuǎn)染這三種載體的細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)組1、2、3;陰性對(duì)照載體命名為GV102-PRPS2-0，轉(zhuǎn)染該載體設(shè)為陰性對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 按照參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 質(zhì)粒的提取與轉(zhuǎn)染 按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞，按照參考文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行操作。取生長狀態(tài)良好的HCT-116細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)。使用Qiagen公司的Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取 0.8 μg 質(zhì)粒加 6.4 μl Enhancer，混勻后加入100 μl Buffer EC中，震蕩混勻1 s，室溫孵育 5 min;加 15 μl Effectene Transfection Reagent，震蕩混勻10 s，室溫孵育10 min;加600 μl IMDM培養(yǎng)基，震蕩混勻1 s，加入細(xì)胞中;6 h后補(bǔ)加血清至10%;72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)PRPS2 mRNA表達(dá)水平 按照參考文獻(xiàn)［8］進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)。采用PCR擴(kuò)增人PRPS2基因，上游引物為:5’-GATTGCGTCATCATCCAG AGT-3’;下游引物為:5’-CATTCGCCTTCTTCCTCTCT T-3’。以管家基因GAPDH為內(nèi)參照，上游引物為:5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT G-3’;下游引物:5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。引物由上海生工公司合成。反應(yīng)條件為:變性94℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并使用BIO-RAD凝膠成像儀觀察拍照并分析電泳條帶，條帶灰度值通過內(nèi)參GAPDH校正，反映各mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)PRPS2蛋白表達(dá)水平 按照參考文獻(xiàn)［8］進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，抗體標(biāo)記從封閉液中取出膜，根據(jù)切角標(biāo)記分別將膜移入目標(biāo)蛋白及內(nèi)參蛋白一抗稀釋液(1∶200)中，置于4℃搖床上搖動(dòng)12-16 h;TBST洗膜3次，10 min/次，再次加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗稀釋液(1∶1 000)，室溫下置于搖床上搖動(dòng)3 h;再用TBST洗膜3次，10 min/次。ECL發(fā)光成像，使用 BIORAD凝膠成像儀觀察拍照并分析蛋白條帶，各條帶灰度值通過內(nèi)參β-actin校正，反映相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 熒光顯微鏡檢測(cè)熒光表達(dá) 將轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞置于熒光顯微鏡下，利用藍(lán)光激發(fā)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。觀察并照相后利用Iamge J軟件分析轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié)果

2.1 PRPS2基因shRNA載體的設(shè)計(jì)與重組

設(shè)計(jì)并合成PRPS2的3對(duì)shRNA序列均為48 bp，其3’末端和5’末端可形成自身堿基配對(duì)，6個(gè)堿基形成loop環(huán)(見圖1);分別與GV102重組形成shRNA質(zhì)粒，命名為 GV102-PRPS2-1、GV102-PRPS2-2、GV102-PRPS2-3。

圖1 PRPS2基因shRNA序列結(jié)構(gòu)Figure 1 The sequence of shRNA of PRPS2

2.2 shRNA質(zhì)粒的質(zhì)量鑒定

將shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌擴(kuò)增后提取，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，其 A260/A280均介于 1.8-2.0，濃度為170-200 μg/ml(見表1)，純度適合轉(zhuǎn)染操作。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其DNA堿基數(shù)，可見條帶介于5 000-8 000 bp之間(見圖2)，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

表1 質(zhì)粒濃度和純度測(cè)定(±s)Table 1 Concentrations and purities of plasmids(±s)

表1 質(zhì)粒濃度和純度測(cè)定(±s)Table 1 Concentrations and purities of plasmids(±s)

shRNA質(zhì)粒 A260/A280 濃度/(μg/ml)GV102-PRPS2-0 1.88 ±0.04 176 ±5 GV102-PRPS2-1 1.83 ±0.02 192 ±8 GV102-PRPS2-2 1.86 ±0.03 188 ±6 GV102-PRPS2-3 1.92 ±0.04 202 ±7

圖2 shRNA質(zhì)粒電泳鑒定Figure 2 Electrophoresis results of of shRNA plasmids

2.3 shRNA質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

將shRNA質(zhì)粒重組序列部分進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列進(jìn)行比對(duì)見圖3 (見第783頁)，證實(shí)shRNA質(zhì)粒中的插入序列(圖中上方所示序列)與設(shè)計(jì)序列完全一致，無堿基缺失或替換。

2.4 shRNA質(zhì)粒對(duì)HCT116細(xì)胞PRPS2表達(dá)的持續(xù)時(shí)間觀察

結(jié)果顯示(以GV102-PRPS2-0為例)，在72 h內(nèi)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間的增加而增強(qiáng)，在72 h時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最大，72 h后逐漸減低(圖4，見第783頁)，說明72 h是觀察轉(zhuǎn)染效果的最佳時(shí)機(jī)。

2.5 shRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)

分別將PRPS2基因的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞72 h后，利用Image J軟件對(duì)熒光顯微鏡照片和光鏡照片進(jìn)行分析，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果 顯示，其轉(zhuǎn)染效率均介于40%-50%，且各組轉(zhuǎn)染效率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表2，圖5，見第783頁)。

表2 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116 72 h轉(zhuǎn)染效率(±s)Table 2 The transfection efficiency of shRNA in 72 h(±s)

表2 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116 72 h轉(zhuǎn)染效率(±s)Table 2 The transfection efficiency of shRNA in 72 h(±s)

分組 shRNA質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染效率/%陰性對(duì)照組GV102-PRPS2-0 47.15 ±4.19實(shí)驗(yàn)組1 GV102-PRPS2-1 47.36 ±8.50實(shí)驗(yàn)組2 GV102-PRPS2-2 40.84 ±1.58實(shí)驗(yàn)組3 GV102-PRPS2-3 48.56 ±19.46

2.6 shRNA質(zhì)粒對(duì)HCT116細(xì)胞PRPS2表達(dá)的影響

分別將PRPS2基因shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞72 h后收集HCT116細(xì)胞分別提取總RNA和總蛋白。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PRPS2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組的細(xì)胞中PRPS2相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而轉(zhuǎn)染GV102-PRPS2-1載體、GV102-PRPS2-2載體、GV102-PRPS2-3載體的實(shí)驗(yàn)組1、2、3的細(xì)胞中PRPS2的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.61±0.03、0.89 ±0.02、0.27 ±0.05，較陰性對(duì)照組 PRPS2 表達(dá)顯著下降(P＜0.05，見圖6)。Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PRPS2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組的細(xì)胞中PRPS2蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組1、2、3的細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量分別為 0.37 ±0.06、0.84 ± 0.05、0.30±0.04，較陰性對(duì)照組 PRPS2 表達(dá)顯著下降(P ＜0.05，見圖7)。其中，GV102-PRPS2-3 使細(xì)胞中PRPS2的mRNA水平下降73%、蛋白水平下降70%，干擾效果優(yōu)于GV102-PRPS2-1和GV102-PRPS2-2。

圖3 shRNA質(zhì)粒測(cè)序鑒定Figure 3 Sequencing identification of shRNA plasmids

圖4 PRPS2基因shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果Figure 4 The transfection efficacy of shRNA plasmids

圖5 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染PRPS2基因shRNA質(zhì)粒后熒光與光鏡比較 (×100)Figure 5 Comparison of transfection rate of shRNA plasmid in HCT116 cells under fluorescence and light microscope (×100)

圖6 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染PRPS2基因shRNA質(zhì)粒后PRPS2 mRNA水平的比較Figure 6 Comparison of PRPS2 mRNA expression level in HCT116 after transfection of shRNA vector

圖7 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染PRPS2基因shRNA質(zhì)粒后PRPS2蛋白水平的比較Figure 7 Comparison of PRPS2 protein expression level in HCT116 cells after transfection of shRNA vector

3 討論

惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人類健康，其中一半以上發(fā)生在發(fā)展中國家［9］。我國作為發(fā)展中國家，惡性腫瘤發(fā)病率總體呈上升趨勢(shì)，發(fā)病率以年均3%-5%的速度遞增［10］。結(jié)直腸癌是消化道最常見腫瘤之一，惡性程度較高，其發(fā)病率在全球最常見的惡性腫瘤中排位第二，每年約有100萬人被確診，并有50萬人死亡［11］。因此，研究針對(duì)結(jié)直腸癌的治療方法極為迫切。

PRPS家族編碼的PRPS蛋白是體內(nèi)嘌呤、嘧啶核苷酸從頭合成和補(bǔ)救合成的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，其中PRPS1基因位于7號(hào)染色體7p21.2區(qū)，PRPS2位于 X染色體短臂 Xp22.2-p22.3區(qū)［12］。PRPS1在增殖較慢或不增殖的組織中表達(dá)量較高，如腦、腎上腺;PRPS2在增殖較快的組織中表達(dá)量高，如胸腺、肺、胃、小腸等［13］。PRPS2基因是髓細(xì)胞增生原癌基因(C-myelocytomatosis oncogene，C-myc)的作用靶點(diǎn)，PRPS2基因的表達(dá)隨C-myc表達(dá)降低而下降，而C-myc基因表達(dá)的下調(diào)可誘導(dǎo)多種細(xì)胞啟動(dòng)以凋零為特征的程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞發(fā)生凋亡的速度及其對(duì)誘導(dǎo)因素的敏感性均依賴于細(xì)胞Myc蛋白的含量［8］，這揭示了PRPS2表達(dá)下調(diào)可能會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。因此，我們將利用 RNAi技術(shù)，構(gòu)建PRPS2干擾載體，特異性下調(diào)PRPS2基因的表達(dá)，觀察其對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

RNAi技術(shù)具有快速、高效、便于操作等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到基因功能研究、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究等領(lǐng)域［14］。siRNA雖然能夠轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)并實(shí)現(xiàn)RNAi作用，但是在體內(nèi)使用時(shí)易被RNase降解，基因沉默維持時(shí)間較短，且合成樣本昂貴，產(chǎn)量較低，轉(zhuǎn)染效率低;shRNA具有緊密發(fā)卡環(huán)，在生物體細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性較好、價(jià)格低廉，還可用抗生素篩選陽性克隆，因而廣泛應(yīng)用于 RNAi［14］。shRNA 的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可被切割成siRNA，然后siRNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，該復(fù)合物能夠結(jié)合到目的mRNA并將其降解［16］。紀(jì)華等［17］通過 RNAi合成 PIAS3 基因的shRNA，構(gòu)建干擾載體，下調(diào)PIAS3基因表達(dá)使膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞阻滯在G2期，拮抗細(xì)胞凋亡。結(jié)合蛋白(NIN1/RPN12 binding protein 1，NOB1)在 20S蛋白酶復(fù)合體成熟和蛋白降解中發(fā)揮重要作用，Lin等［18］利用shRNA載體下調(diào)NOB1基因的表達(dá)，可以明顯降低卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，NOB1基因低表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞停滯于G0/G1期，并推測(cè)NOB1可能是一種新的致癌靶點(diǎn)。趙東利等［19］發(fā)現(xiàn)人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)編碼的蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞中可能是潛在的抗癌靶點(diǎn)，利用shRNA干擾載體轉(zhuǎn)染HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞可以誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G0/G1期并發(fā)生凋亡，推測(cè)HER2可能在腫瘤惡化及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。因此，本課題采用了載體介導(dǎo)shRNA進(jìn)行RNAi的方法。

Yu等［20］構(gòu)建了RNAi載體，下調(diào)多藥耐藥相關(guān)蛋白 4(multidrug resistance-associated protein 4，MRP4)在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)，輻射24 h后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，凋亡率上升了12%，提示下調(diào)MRP4表達(dá)可以提高HCT116細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性。有研究［21，22］利用 RNAi技術(shù)，下調(diào) HCT116 細(xì)胞中Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1，PLK1)的表達(dá)，導(dǎo)致HCT116細(xì)胞凋亡增加81%，提示PLK1可能是結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)。因此本研究同樣利用RNAi技術(shù)，根據(jù)人PRPS2 mRNA設(shè)計(jì)并合成了3個(gè)特異性shRNA靶序列，構(gòu)建了3個(gè)重組shRNA質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116。通過對(duì)轉(zhuǎn)染時(shí)間變化的觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染72 h時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高;通過 RT-PCR和 Western blot分析，GV102-PRPS2-3對(duì)PRPS2表達(dá)的抑制效果最強(qiáng)，抑制率達(dá)68.4%左右，后續(xù)研究以轉(zhuǎn)染72 h后GV102-PRPS2-3對(duì)HCT116細(xì)胞行為和基因表達(dá)的影響為主要研究對(duì)象，下調(diào)HCT116細(xì)胞中PRPS2基因的表達(dá)，為深入探討PRPS2表達(dá)下調(diào)后對(duì)細(xì)胞行為的影響奠定了研究基礎(chǔ)。

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