吳燕利，祁克宗，涂 健，汪雪雁，張 明，付瑞燕

(安徽農(nóng)業(yè)大學，安徽合肥230036)

長期以來，抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的廣泛使用，造成許多病原菌對其產(chǎn)生耐藥性而難以被消滅，增加了疾病爆發(fā)風險，而且畜禽產(chǎn)品中抗生素藥物殘留也嚴重威脅著人類的健康。抗生素的使用也嚴重破壞了動物腸道中的微生態(tài)平衡，影響畜禽產(chǎn)品的品質(zhì)，進而影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)的良性發(fā)展。抗菌肽因具有廣譜抗菌作用且抗菌機理獨特，而成為目前抗生素替代品和新型飼料添加劑及食品防腐劑的研究熱點［1-2］。乳酸菌是食品中常見微生物，也是構(gòu)成人和大多數(shù)動物天然的腸道菌群，其在代謝過程中能產(chǎn)生有機酸、二乙酰、過氧化氫及細菌素等活性物質(zhì)，能夠抑制致病微生物和腐敗微生物生長，而被廣泛應用［3-4］。乳酸菌源抗菌肽包括細菌素和類細菌素等活性物質(zhì)，是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類分子質(zhì)量小、無毒、具有抗菌活性的蛋白質(zhì)、多肽或者前體多肽及其修飾物［5］。該類抗菌肽能抑制或殺滅其他微生物［6］，而宿主乳酸菌對其有自身免疫性［7-8］，還具有能被人和動物體內(nèi)的蛋白酶降解、不在體內(nèi)蓄積、不造成體內(nèi)藥物殘留等優(yōu)點［9］;此外，乳酸菌還具有改善動物消化道微生態(tài)平衡、增強機體免疫力、促進機體營養(yǎng)利用及生長等特點［10］，因而利用乳酸菌及其抗菌肽開發(fā)抗生素替代品及新型飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中有著潛在的應用價值。已有研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌能產(chǎn)生抑菌活性強、抑菌范圍廣的抗菌肽［11-13］，能夠抑制 DNA的合成。本實驗通過比較三株乳桿菌的抑菌活性大小，從中篩選出了一株有較強抗菌活性的干酪乳桿菌，研究了其所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的特性，并優(yōu)化了其產(chǎn)生抗菌肽的代謝條件，為該菌株及其抗菌肽在天然防腐劑和畜禽飼料添加劑上的研究開發(fā)利用奠定了科學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei 1.2435)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum 1.2133)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus 1.1854) 中國普通微生物菌種保藏管理中心;大腸埃希氏菌(Escherichia coli CMCC44102)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu ATCC25923)等 安徽農(nóng)業(yè)大學基礎(chǔ)病理實驗室;MRS培養(yǎng)基 Oxoid公司;蛋白酶K Sigma公司;胰蛋白酶 BBI;木瓜蛋白酶和中性蛋白酶 Sangon;胃蛋白酶和α-淀粉酶 北京索萊寶科技有限公司。

真空冷凍干燥機 alpha-2型，德國chrst公司;離心機 2K15型，Sigma公司;紫外可見分光光度計 WFZ UV-2100，尤尼柯(上海)儀器有限公司;培養(yǎng)箱 SPX-250B-Z型，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的篩選 用接種環(huán)從凍存管中取出干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌分別于MRS斜面上劃線，密封后于37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，活化2次后挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。取其過夜培養(yǎng)物，以1%的接種量接種到MRS液體中，37℃靜置培養(yǎng)30h，培養(yǎng)液于4℃、8000×g離心10min收集上清液，用0.22μm無菌微孔濾膜過濾，制成濃縮液。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，瓊脂擴散法［14］測定其抑菌活性，每種指示菌重復一次。

1.2.2 抑菌物質(zhì)屬性鑒定 取適量培養(yǎng)上清濃縮液于80℃水浴10min以排除H2O2，測定其抑菌活性;用6mol/L NaOH溶液將培養(yǎng)上清液調(diào)至 pH5.0，以pH5.0的乳酸溶液作對照測定其抑菌活性變化;將培養(yǎng)上清液用HCl、NaOH溶液分別調(diào)為酶的最適作用pH，分別加入ɑ-淀粉酶和胰蛋白酶，使其終濃度為1mg/mL，37℃溫浴2h，將pH調(diào)回到5.0，測定上清液的抑菌活性。

1.2.3 無細胞發(fā)酵上清液的制備 將篩選出的抑菌乳酸菌于MRS液體中發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)液于4℃、8000×g離心10min收集上清液，用5mol/L NaOH溶液調(diào)至pH5.0，再用0.22μm無菌微孔濾膜過濾，以除去菌體和其它雜質(zhì)，冷凍濃縮，-20℃冰箱中備用。后續(xù)實驗所用發(fā)酵液均采用此操作。

1.2.4 抑菌乳酸菌的生長量與抑菌活性相關(guān)性測定 取干酪乳桿菌的過夜培養(yǎng)物以1%的接種量接種到MRS液體中，37℃靜置培養(yǎng)，定時取樣，測定其10倍稀釋培養(yǎng)物的OD600及其發(fā)酵上清液的抑菌活性，繪制抑菌活性與生長量關(guān)系曲線，分析二者之間的相關(guān)性。

1.2.5 產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最適培養(yǎng)條件優(yōu)化 以干酪乳桿菌為發(fā)酵菌株，以大腸埃希氏菌為指示菌，對培養(yǎng)條件中的溫度分別設(shè)置在 27、30、33、37、42℃，接種量分別設(shè)置為0.5%、1%、2%、4%、8%和裝液量分別調(diào)整為5%、10%、20%、40%、60%，以 MRS液體為發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵36h，進行單因素分析，以檢測這些因素對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響。

為了提高發(fā)酵上清液的抑菌活性，根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇發(fā)酵時間、溫度、接種量和裝液量4個因素，并選取適當?shù)?水平優(yōu)化干酪乳桿菌產(chǎn)抗菌肽的最佳培養(yǎng)條件，設(shè)計了L9(34)正交實驗(如表1)。根據(jù)正交實驗分析表，安排了9組實驗(如表3)，每組3個平行，所有實驗組均于厭氧條件下靜置培養(yǎng)，隨后分別取樣測定發(fā)酵上清的抑菌圈直徑。

表1 正交分析表Table 1 The table of orthogonal analysis

1.2.6 發(fā)酵上清液對溫度、pH和酶的穩(wěn)定性 a.取等量發(fā)酵上清液(pH5.0)，分別在 60、80、100 和121℃保持10、30min，于冰中迅速冷卻后測定其抑菌活性;b.取等量發(fā)酵上清液，用HCl、NaOH分別調(diào)pH為2～10，37℃下溫育2h后測定其抑菌活性;c.取等量發(fā)酵上清液，用 HCl、NaOH調(diào)到酶的最適作用pH，分別加入中性蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶，使其終濃度為1mg/mL，37℃溫浴2h，將pH調(diào)回到5.0，測定其抑菌活性。

1.2.7 發(fā)酵上清液對指示菌的作用方式 取4mL發(fā)酵上清濃縮液加入到20mL培養(yǎng)到穩(wěn)定期的大腸埃希氏菌CMCC44102菌液中，37℃培養(yǎng)，每隔1h從中取適量菌液稀釋10倍后測定OD600，并取1mL菌液進行梯度稀釋后，平板計數(shù)法測定其活菌數(shù)。以4mL MRS濃縮液處理的大腸埃希氏菌培養(yǎng)液作為對照。

1.2.8 抑菌譜的測定 利用瓊脂擴散法，制作含不同指示菌的平板，指示菌終濃度為106CFU/mL(酵母菌為104個/mL)，取發(fā)酵上清液40μL加入孔內(nèi)，于各指示菌最適生長溫度下培養(yǎng)適當時間，用游標卡尺測量各抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的篩選結(jié)果

分別收集三種乳桿菌的培養(yǎng)上清液，以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法分析其抑菌圈大小，結(jié)果如圖1，可知三種乳桿菌均有抑菌活性，其中干酪乳桿菌的抑菌圈最為明顯，對大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑達到20.08mm(孔徑為7mm)。

表2 抑菌物質(zhì)性質(zhì)的研究Table 2 The study on nature of antimicrobial components

圖1 三株乳桿菌發(fā)酵上清液的抑菌作用Fig.1 Antimicrobial activity of fermentation supernatants from three lactobacillus

2.2 抑菌活性物質(zhì)屬性鑒定

乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的強氧化劑H2O2以及乳酸、乙酸等有機酸能夠強烈抑制微生物生長，尤其抑制G-菌的生長。利用H2O2對熱不穩(wěn)定的特性，通過熱處理來去除H2O2的作用，處理前后的抑菌圈直徑基本無變化;以pH5.0的有機酸溶液為對照，檢測同樣條件下的發(fā)酵液仍有很高的抑菌活性;經(jīng)ɑ-淀粉酶處理前后的發(fā)酵上清液的抑菌圈大小無顯著變化，而經(jīng)胰蛋白酶處理后的發(fā)酵上清液，抑菌圈消失，結(jié)果見表2。這些說明了發(fā)酵上清液中起主要抑菌作用的物質(zhì)既不是H2O2和有機酸也不是多糖，而是蛋白質(zhì)類，是一種細菌素類抗菌肽，且該蛋白無糖基化結(jié)構(gòu)或者其活性不依賴于糖基化。

2.3 生長量與抑菌活性的相關(guān)性

干酪乳桿菌在MRS液體中于37℃培養(yǎng)，其生長量OD600和發(fā)酵上清液抑菌活性隨時間的變化曲線如圖2所示。該菌株在6h時已度過了延滯期而進入對數(shù)生長期，18h開始進入穩(wěn)定期，在60h后菌株開始衰亡;抑菌物質(zhì)在穩(wěn)定期初期(18h)開始產(chǎn)生，進入穩(wěn)定期后其產(chǎn)量繼續(xù)增加，在穩(wěn)定期中期36h后其產(chǎn)量不再增加，其抑菌活性基本維持穩(wěn)定，60h后其抑菌活性開始下降。其活性下降的原因可能是抗菌肽被菌體衰亡過程中產(chǎn)生的蛋白酶降解，或是被吸附到菌體上，也可能是反饋調(diào)節(jié)作用抑制其產(chǎn)生［15］。

2.4 產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最適培養(yǎng)條件優(yōu)化

圖2 發(fā)酵上清抑菌活性與生長量的相關(guān)性Fig.2 The correlation of antibacterial activity of fermentation supernatant and growth of lactobacillus

2.4.1 培養(yǎng)溫度對菌體密度及發(fā)酵液抑菌效果的影響 由于溫度能夠影響生物膜的液晶結(jié)構(gòu)以及蛋白類酶活性從而影響微生物的生命活動［16］，影響代謝產(chǎn)物的類型及產(chǎn)量，進而影響其抑菌活性。當以1%接種量和40%裝液量為基礎(chǔ)條件，培養(yǎng)溫度對菌體密度和發(fā)酵液抑菌活性的影響如圖3。由圖3可知，該菌株在37℃下菌體生長狀況最好(菌體密度最高)，但在30℃下培養(yǎng)時的發(fā)酵液抑菌圈直徑最大，隨著溫度的升高，該菌株的生物量及其產(chǎn)物抑菌圈直徑均明顯減小，原因是由于干酪乳桿菌的最適生長溫度為37℃，但是最適生長溫度只能說明該溫度有利于其生長繁殖，并不等于也有利于其產(chǎn)生抗菌肽。故選擇30℃作為其最佳發(fā)酵溫度。

圖3 溫度對菌體密度及其發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of culture temperature on antimicrobial activity of fermentation liquid and growth of lactobacillus

2.4.2 接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響 由于接種量的高低直接影響著菌株延滯期的長短及其達到最大菌體量所需時間的長短，進而也影響了抗菌肽的產(chǎn)量。當以40%裝液量于30℃培養(yǎng)為基礎(chǔ)時，不同接種量對菌體密度和發(fā)酵液抑菌活性的影響如圖4。由圖4可知，較高接種量不是促進反而限制了菌體生長和抗菌肽的產(chǎn)生，原因可能是由于種子液中夾雜的一些菌體代謝產(chǎn)物影響了菌體的進一步生長，也可能是由于過高的接種量使得菌體濃度增長過快，造成營養(yǎng)物質(zhì)過度消耗及有害代謝產(chǎn)物的積累增多，加速了細胞的衰亡。故選擇2%作為發(fā)酵的最佳接種量。

圖4 接種量對菌體密度及其發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of inoculum dose on antimicrobial activity of fermentation liquid and growth of lactobacillus

2.4.3 裝液量對發(fā)酵液抑菌活性的影響 當以1%接種量于30℃培養(yǎng)為基礎(chǔ)時，不同裝液量5%、10%、20%、40%、60%對菌體密度和發(fā)酵液抑菌活性的影響如圖5。由圖5可知，裝液量為20%時菌體量和抑菌圈直徑都最大，裝液量過高或過低均不利于菌體生長和抗菌肽的產(chǎn)生，原因可能是裝液量過低，培養(yǎng)瓶中的氧氣濃度過高，不利于厭氧菌的生長;而裝液量過高時由于靜置培養(yǎng)使得菌體集中于底部，產(chǎn)生了局部高濃度菌體，進而產(chǎn)生了局部高濃度的有害代謝產(chǎn)物，加速了菌體的衰亡并抑制了抗菌肽的產(chǎn)生，然而測定時將發(fā)酵液混勻后使得菌體濃度和抗菌肽濃度稀釋。故選擇20%為發(fā)酵的最佳裝液量。

圖5 裝液量對菌體密度及其發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of broth volume on antimicrobial activity of fermentation liquid and growth of lactobacillus

2.4.4 正交實驗確定產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最適條件 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，以影響抗菌肽產(chǎn)生的接種量、裝液量、溫度、發(fā)酵時間為正交實驗的四個設(shè)計因素，分別取三個水平。以最佳值及其左右值進行取值，但由于最初確定的發(fā)酵時間是在較高溫度下，而最佳溫度略低，最適發(fā)酵時間可能會延長，故將發(fā)酵時間作適當延長，而選擇36、42、48h三個水平。根據(jù)L9(34)設(shè)計正交實驗，實驗方案和結(jié)果分析如表3。

由表3可以看出，影響發(fā)酵液抑菌圈直徑的因素順序為B＞A＞C＞D，抗菌肽產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)條件為A2B2C2D2。極差分析顯示:裝液量對發(fā)酵液抑菌圈直徑影響最大，其次是接種量，而發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌圈直徑的影響最小。

表3 正交實驗分組及結(jié)果Table 3 The groups and results of orthogonal tests

2.4.5 最適培養(yǎng)條件的驗證 由于正交實驗所得結(jié)果A2B2C2D2與單因素實驗所得最佳條件A2B2C2D1不一致，為了確定代謝產(chǎn)抗菌肽最佳培養(yǎng)條件，按照兩種組合方案分別進行5批次的發(fā)酵培養(yǎng)，并分別測定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。在A2B2C2D2培養(yǎng)條件下，抑菌圈直徑為24.35mm，高于在A2B2C2D1培養(yǎng)下的抑菌直徑為23.41mm(數(shù)據(jù)未顯示)。為了得到干酪乳桿菌發(fā)酵上清液有最佳的抑菌活性，故選擇其代謝產(chǎn)生抗菌肽的最佳培養(yǎng)方案為A2B2C2D2，即干酪乳桿菌在裝液量20%、接種量2%、培養(yǎng)溫度30℃下靜置培養(yǎng)42h時的發(fā)酵液上清的抑菌圈直徑最大，也即代謝產(chǎn)生的抗菌肽含量最高。

2.5 發(fā)酵上清液對溫度、pH和酶的穩(wěn)定性

由表4中發(fā)酵上清液在不同熱處理條件下的抑菌活性變化可知，60℃處理10、30min和80℃處理10、30min對其抑菌活性基本無影響，隨著溫度的進一步升高和時間的延長，抑菌活性有所下降，121℃處理30min后，抑菌活性下降了22.28%，但仍有較強的抑菌活性，說明該菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性;發(fā)酵上清液的抑菌活性隨著pH的升高逐漸降低，當pH高于6.0抑菌活性明顯下降，而在酸性環(huán)境中顯示出較強的抑菌活性，可能是由于酸增強了該抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性，而且酸對指示菌也有一定的抑制作用，該抑菌物質(zhì)與酸共同作用能更好的抑制指示菌的生長;發(fā)酵上清液經(jīng)過胃蛋白酶處理后活性無明顯變化，而經(jīng)過蛋白酶K處理后抑菌活性下降了38.55%，經(jīng)過木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶處理后抑菌活性則完全喪失，原因可能是該抗菌肽未被胃蛋白酶酶解或其活性中心未遭破壞，而經(jīng)蛋白酶K處理使該多肽的活性中心遭到部分破壞，經(jīng)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶酶解卻使其活性中心遭受大面積破壞以致喪失活性。

表5 發(fā)酵上清濃縮液的抑菌譜Table 5 Antimicrobial spectrum of fermentation liquid

表4 發(fā)酵上清濃縮液對溫度、pH和酶的敏感性Table 4 Factors affecting the antimicrobial activity of fermentation supernatant

2.6 發(fā)酵上清液對指示菌的作用方式

實驗中直接將干酪乳桿菌的發(fā)酵上清濃縮液加入到培養(yǎng)至穩(wěn)定期的大腸埃希氏菌菌液中，37℃下作用5h后，大腸桿菌活菌數(shù)迅速減少，由起始菌數(shù)3.84×108CFU/mL下降至8.34×106CFU/mL，而加入相同處理的MRS培養(yǎng)基的對照組菌液中活菌數(shù)未見減少，見圖6。OD600在2h后與對照相比未發(fā)生明顯變化，說明指示菌總菌數(shù)無顯著變化，但活菌數(shù)卻減少了約1.6個單位，由此可見，干酪乳桿菌發(fā)酵上清液的抗菌作用方式是殺菌。

2.7 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的部分抑菌譜

從表5中可以看出，該菌株所產(chǎn)抗菌肽能夠抑制或殺滅多種革蘭氏陰性細菌和部分革蘭氏陽性菌，具有較廣的抗菌活性。發(fā)酵上清液對常見病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、巴氏桿菌、銅綠假單胞菌都有較強的抑菌作用，對枸櫞酸桿菌、沙門氏菌也有一定的抑菌活性，但對白色念珠菌、畢赤酵母無顯著抑菌活性。因此，其在新型食品防腐劑和飼料添加劑領(lǐng)域有著較廣闊的應用前景。

圖6 發(fā)酵上清液對大腸埃希氏菌的作用Fig.6 The effect of fermentation liquid on the growth of Escherichia coli CMCC44102

3 結(jié)論

利用瓊脂擴散法對嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和干酪乳桿菌等三株乳桿菌的發(fā)酵上清液抑菌活性分析表明，在相同條件下，干酪乳桿菌的發(fā)酵上清液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強的抑菌活性，而嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的抑菌活性較弱。其發(fā)酵上清經(jīng)過有機酸和過氧化氫排除及酶解實驗進而確定所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)屬性。

通過單因素實驗和正交分析最終確定了干酪乳桿菌代謝產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件，即干酪乳桿菌在裝液量20%、接種量2%、培養(yǎng)溫度30℃下靜置培養(yǎng)42h時的發(fā)酵液上清的抑菌圈直徑最大，也即代謝產(chǎn)生的抗菌肽含量最高。

本實驗中干酪乳桿菌所產(chǎn)的抗菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性，可被胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶完全酶解，被蛋白酶K部分酶解，而不被胃蛋白酶酶解，其活性受pH影響很大，酸性環(huán)境中活性較高。同時，對其作用方式的研究發(fā)現(xiàn)，其對大腸埃希氏菌的作用為殺菌;對其抑菌譜的研究發(fā)現(xiàn)，該抗菌物質(zhì)對G+和G-菌株均有較強的抑制作用，能夠抑制大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等食源性病原菌。這些為干酪乳桿菌及其抗菌物質(zhì)在食品工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)上的進一步研究奠定了基礎(chǔ)，并為開發(fā)天然防腐劑［17］和畜禽用新型飼料添加劑提供了廣闊的市場前景。

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