王 晶，馬文君，陳 勇，王中江，王 瑞，李 楊，柏 晶，江連洲，2，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030;2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心哈爾濱150030)

黑豆又名櫓豆、料豆、零烏豆，它呈卵圓形或球形，表皮黑色或深綠色，全國(guó)各地均有生產(chǎn)，以東北產(chǎn)量最多［1］。黑豆含有豐富的蛋白質(zhì)，含粗蛋白質(zhì)34%，每100g黑豆含蛋白質(zhì)最高可達(dá)49.8%，比黃豆高 24.5%［2］，甚至高于肉類(lèi)、雞蛋和牛奶，素有“植物蛋白之王”的美譽(yù)［3］。

傳統(tǒng)的蛋白的提取工藝是堿提酸沉法，但該法存在提取率較低，提取時(shí)間較長(zhǎng)，溶劑消耗量大等缺點(diǎn)［4］。超聲輔助提取技術(shù)可以促進(jìn)固體物料中有效成分的溶出，能有效地提高提取效率［5］，降低成本［6］。但同時(shí)會(huì)對(duì)蛋白分子結(jié)構(gòu)和功能特性產(chǎn)生影響［7-10］。

本文堿溶酸沉法的基礎(chǔ)上采用超聲波輔助提取黑豆蛋白，以蛋白提取率為指標(biāo)，利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法分析不同因素對(duì)總蛋白提取效果的影響，并對(duì)提取工藝進(jìn)行了條件優(yōu)化。并探究超聲波輔助提取對(duì)黑豆蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性等功能性質(zhì)的影響，為高效提取黑豆蛋白及其開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆 由北大荒綠野食品有限公司提供，脫皮粉碎后過(guò)60目篩，正己烷萃取以制備脫脂黑豆粉，晾干備用;Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司;氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、正己烷、鹽酸等試劑 國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 中國(guó)上海雷磁公司;錘片式粉碎機(jī) 中國(guó)天津泰斯特儀器有限公司TU-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)SIM公司;電子分析天平(0.0001g)北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;FJ300-S數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) 上海越磁電子科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑豆原料成分的測(cè)定 水分的測(cè)定:GB304-87進(jìn)行測(cè)定;粗脂肪的測(cè)定:GB5512-85中索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定;粗蛋白的測(cè)定:GB6432-94標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行;灰分測(cè)定:GB5009.4-85。

1.3.2 超聲輔助提取黑豆蛋白工藝流程與方法

1.3.2.1 超聲輔助提取黑豆蛋白工藝流程 黑豆→清理→粉碎→過(guò)篩→脫脂→加堿液調(diào)pH至8→超聲處理→離心分離→取上清液→加酸液調(diào)pH至4.5→離心分離→取沉淀→反復(fù)水洗和離心→黑豆蛋白

1.3.2.2 傳統(tǒng)提取黑豆蛋白工藝流程 黑豆→清理→粉碎→過(guò)篩→脫脂→加堿液調(diào)pH至8→離心分離→取上清液→加酸液調(diào)pH至4.5→離心分離→取沉淀→反復(fù)水洗和離心→黑豆蛋白

1.3.2.3 蛋白提取率計(jì)算公式

蛋白提取率(%)=提取黑豆蛋白的質(zhì)量/(脫脂黑豆粉質(zhì)量×45.1%)×100

注:45.1%為原料黑豆測(cè)得的蛋白含量。

1.3.2.4 超聲輔助提取黑豆蛋白單因素實(shí)驗(yàn) 以黑豆蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同液固比、pH、超聲功率及超聲時(shí)間對(duì)提取黑豆蛋白的主要影響。

1.3.2.5 超聲輔助提取黑豆蛋白響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素研究的基礎(chǔ)上，確定各因素的水平值范圍，采用響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取液固比，混合液pH，超聲強(qiáng)度，超聲時(shí)間4個(gè)因素為自變量，以黑豆蛋白提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化超聲輔助提取黑豆蛋白工藝的最佳參數(shù)。其因素水平編碼表見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.3.3 超聲輔助提取黑豆蛋白功能性測(cè)定

1.3.3.1 溶解性測(cè)定 稱(chēng)取100mg黑豆蛋白樣品分散于10mL的去離子水中，磁力攪拌30min，20℃、12000×g離心20min。上清液經(jīng)適度稀釋?zhuān)捎肔owry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度的百分比［11］。

1.3.3.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定 將24mL蛋白濃度為0.2%(w/v)的蛋白溶液與8mL大豆油混合，在13500r/min高速均質(zhì)機(jī)下乳化2min，，將乳化液迅速倒入25mL小燒杯中，立即開(kāi)始取樣，用微量注射器迅速?gòu)牡撞课∪榛?0μL與5mL，0.1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液均勻混合，在500nm處測(cè)定其吸光值，記為 A0，用0.1%的 SDS做空白對(duì)照［12］。按下式計(jì)算乳化性(emulsifying capacity，EC):

其中T=2.303，N:稀釋倍數(shù)250，C:乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度(g/mL)，U:乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)(0.25)。

將乳狀液靜置30min后采用用相同的方法測(cè)定乳狀液吸光值，記為A30，用0.1%的SDS做空白對(duì)照。按下式計(jì)算乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability，ES):

1.3.3.3 起泡性及起泡穩(wěn)定性測(cè)定 將一定濃度的SPI溶液100mL置于500mL量筒中，使用高速乳化均質(zhì)機(jī)以17500r/min的速度均質(zhì)40s，連續(xù)3次共計(jì)2min，記錄均質(zhì)后的液面高度，記為V0，靜置30min后再次記錄液面高度，記為 V30［13］。起泡能力(Foaming Capacity)和泡沫穩(wěn)定性(Foaming Stability)公式如下:

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑豆的主要成分

黑豆的主要成分如表2所示。

表2 黑豆的主要成分(%)Table 2 The main components of soybean(%)

2.2 超聲輔助提取單因素條件對(duì)黑豆蛋白提取率的影響

2.2.1 液固比對(duì)黑豆蛋白提取率的影響 液固比對(duì)提取率的影響如圖1。由圖1可知，隨著液固比的升高，蛋白質(zhì)提取率先升高而后緩慢下降。在低液固比的條件下，體系分散不均，蛋白質(zhì)無(wú)法充分溶解［14］，但當(dāng)液固比大于9∶1蛋白質(zhì)提取率明顯增加，這時(shí)稀釋作用大于蛋白質(zhì)的溶出。但當(dāng)液固比大于13∶1，蛋白質(zhì)提取率呈下降趨勢(shì)，所以在下面的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中液固比選擇 9∶1～13∶1。

2.2.2 pH對(duì)黑豆蛋白提取率的影響 pH對(duì)提油率的影響見(jiàn)圖2。如圖2可知，在液固比0.09，超聲時(shí)間20min，超聲功率300W條件下，隨著pH的增加，蛋白提取率逐漸增加，當(dāng)pH在9～11附近有較大值出現(xiàn)，提取率最高，這可能是因?yàn)閴A性條件下，蛋白分子結(jié)構(gòu)疏松，堿液對(duì)蛋白有增容效果，而后隨著pH的增加，堿性的增強(qiáng)，蛋白質(zhì)易發(fā)生變性，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，提取率下降［5］。所以在下面的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中pH選擇9～11。

圖1 液固比對(duì)黑豆蛋白提取率的影響Fig.1 Liquid-material ratio on the effect of protein extraction

圖2 pH對(duì)黑豆蛋白提取率的影響Fig.2 pH on the effect of protein extraction

2.2.3 超聲功率對(duì)黑豆蛋白提取率的影響 超聲功率對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖3。如圖3所示，當(dāng)功率大于200W時(shí)，提取率上升，變化程度較明顯，超聲有助于蛋白分子的展開(kāi)，增加了與水分子的接觸面積，促進(jìn)了蛋白的溶解。當(dāng)功率大于300W時(shí)，提取率下降，這可能是因?yàn)槌暪β试黾影殡S熱效應(yīng)，使蛋白發(fā)生變性，影響溶出效果，導(dǎo)致提取率下降［15］。所以在下面的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中超聲功率選擇200～400W。

圖3 超聲功率對(duì)黑豆蛋白提取率的影響Fig.3 Ultrasonic power on the effect of protein extraction

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)黑豆蛋白提取率的影響 超聲時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖4。如圖4所示，當(dāng)時(shí)間大于15min時(shí)，提取率大幅上升，變化程度較明顯，當(dāng)時(shí)間大于20min時(shí)，提取率開(kāi)始下降，原因是20min時(shí)水溶性蛋白已被浸提出來(lái)，浸提液濃度達(dá)到平衡，延長(zhǎng)超聲時(shí)間，超聲產(chǎn)生的空穴效應(yīng)和熱效應(yīng)會(huì)使蛋白部分發(fā)生變性，造成提取率的下降［16］。所以在下面的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中超聲時(shí)間選擇15～25min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)黑豆蛋白提取率的影響的影響Fig.4 Ultrasonic time on the effect of protein extraction

2.3 超聲輔助提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行過(guò)程優(yōu)化。以 x1、x2、x3、x4為自變量，以分離蛋白提取率為響應(yīng)值Y，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)號(hào)1～24為分析實(shí)驗(yàn)，25～31為7個(gè)中心實(shí)驗(yàn)，用以評(píng)估實(shí)驗(yàn)誤差。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and result of response surface analysis

表4 回歸與方差分析結(jié)果Table 4 Results of regression and variance analysis

2.3.2 超聲輔助提取工藝參數(shù)對(duì)黑豆蛋白提取率的響應(yīng)面結(jié)果分析 通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS9.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下:

Y=96.01-0.48x1+1.87x2+0.53x3+2.40x4-3.08x1x2-1.27x1x3+3.14x1x4-1.43x2x3+0.081x2x4-3.18x3x4-3.34x12-2.58x22-1.51x32-6.57x42?；貧w分析與方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，當(dāng)超聲時(shí)間為 24min，pH為 9.7，超聲功率為378.5W，液固比為10.6∶1，響應(yīng)面有最優(yōu)值為56.63%±0.42%。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與對(duì)比實(shí)驗(yàn) 在響應(yīng)面分析在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件，為了方便操作進(jìn)行修定:即當(dāng)超聲時(shí)間為 24min，pH為 9.7，超聲功率為380W，液固比為10.6∶1條件下，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到3次平行實(shí)驗(yàn)黑豆蛋白提取率的平均值為56.26%，黑豆蛋白提取率的預(yù)測(cè)值為56.63% ±0.42%，說(shuō)明響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好。

2.4 超聲輔助提取對(duì)黑豆蛋白功能性影響

2.4.1 溶解性 分別測(cè)量由響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的到超聲輔助提取黑豆蛋白最佳參數(shù)提取得到蛋白和傳統(tǒng)堿溶酸沉提取出黑豆蛋白的溶解性，結(jié)果如圖5所示，由圖可見(jiàn)，超聲輔助提取比傳統(tǒng)堿溶酸沉得到的黑豆蛋白的溶解性得到明顯的提高，這是由于超聲出來(lái)可以減小黑豆蛋白的粒徑大小，增大蛋白分子與水分子的接觸機(jī)會(huì)，從而提高黑豆蛋白的溶解度［17］。

圖5 超聲輔助提取與堿溶酸沉提取黑豆蛋白溶解性Fig.5 The Solubility of ultrasonic extraction and alkali-soluble and acid precipitation of black bean protein

2.4.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性 分別測(cè)量由響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的到超聲輔助提取黑豆蛋白最佳參數(shù)提取得到蛋白和傳統(tǒng)堿溶酸沉提取出黑豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示，由圖可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)超聲處理提取的黑豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性都有所提高，這是由于超聲處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，疏水基團(tuán)數(shù)量的增加會(huì)使蛋白更傾向于吸附在空氣/水或油/水界面，造成乳化能力的升高［18］。

圖6 超聲輔助提取與堿溶酸沉提取黑豆蛋白乳化性與乳化穩(wěn)定性Fig.6 Emulsifying and emulsion stability of ultrasonic extraction and alkali-soluble and acid precipitation of black bean protein

2.4.3 起泡性及起泡穩(wěn)定性 分別測(cè)量由響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的到超聲輔助提取黑豆蛋白最佳參數(shù)提取得到蛋白和傳統(tǒng)堿溶酸沉提取出黑豆蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7所示，由圖可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)超聲處理提取的黑豆蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性都有所提高，這歸因于超聲處理的勻質(zhì)化效應(yīng)，會(huì)使蛋白和脂肪顆粒更加均勻分散［19］。

圖7 超聲輔助提取與堿溶酸沉提取黑豆蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性Fig.7 Foaming and foam stability of ultrasonic extraction and alkali-soluble and acid precipitation of black bean protein

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面分析方法從黑豆中提取黑豆蛋白超聲處理工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)超聲處輔助提取工藝參數(shù):超聲時(shí)間為24min，pH為9.7，超聲功率為380W，液固比為10.6∶1。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證與對(duì)比實(shí)驗(yàn)可知在最優(yōu)超聲輔助提取工藝參數(shù)條件下黑豆蛋白提取率可達(dá)56.26%。同時(shí)超聲輔助提取出的黑豆蛋白的功能性質(zhì)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)超聲處理后的黑豆蛋白的溶解性，乳化性與乳化穩(wěn)定性，起泡性和起泡穩(wěn)定性都得到一定程度的提高，說(shuō)明超聲輔助提取黑豆蛋白具有提取率高，節(jié)省時(shí)間，節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)得到的黑豆蛋白也具備良好的功能特性。

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