黃曉杰，劉禺嘉，田雪瑛，孫 碩，閆 娣

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001;2.遼寧省肉類加工與質(zhì)量安全控制工程研究中心，遼寧錦州121001)

桑葚(mulberry fruit)，又稱桑果、桑棗，為桑科落葉喬木桑樹的成熟果穗，每年約4～6月份果實(shí)成熟［1］。桑葚味甘性寒，酸甜汁多，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含鞣酸、蘋果酸、多種維生素和人體必需的氨基酸及鋅、鉀、鎂、磷等微量礦質(zhì)元素，成熟桑葚含有豐富的花色苷化合物，具有良好的保健功能［2］。桑葚最大弱點(diǎn)是不耐儲(chǔ)存，采收后極易失水、變質(zhì)，進(jìn)行桑葚深加工研究有利于緩解該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

桑葚中糖、酸、花色苷等含量均適于釀酒［1］，且出汁率高，以桑葚作為原料發(fā)酵釀酒，既保存了桑葚中豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和功能性成分，增加了市場(chǎng)上果酒的種類，又可以克服其不耐貯藏性，增加桑葚的附加值，為桑葚的發(fā)展提供了廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)主要研究桑葚酒主發(fā)酵、后發(fā)酵中品質(zhì)及抗氧化物質(zhì)的變化規(guī)律，探索桑葚酒發(fā)酵過程中品質(zhì)和抗氧化物質(zhì)的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚 遼寧錦州產(chǎn)地;釀酒酵母 安琪果酒專用酵母;其它分析試劑均為分析純。

紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;5810R冷凍離心機(jī) Eppendorf(中國(guó))公司;電子天平 上海恒平有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑葚酒發(fā)酵工藝 參照葡萄酒釀造工藝［3］制定了桑葚酒發(fā)酵的基本工藝。

桑葚→挑選→清洗→破碎、壓榨→加蔗糖調(diào)糖度→按照8%接種活化好的活性干酵母(酵母活細(xì)胞數(shù)量0.4×107cfu/mL)→酒精發(fā)酵(發(fā)酵溫度控制在20～25℃)→分離、澄清→桑葚原酒→成分測(cè)定

桑葚酒主發(fā)酵期間(前6d)隔天測(cè)定理化指標(biāo)，后發(fā)酵期間(6d后)每周測(cè)定一次理化指標(biāo)。

1.2.2 酵母活細(xì)胞數(shù) 采用梯度稀釋法測(cè)定釀酒酵母在發(fā)酵過程中的酵母活細(xì)胞數(shù)量的變化。取5mL桑葚果酒酒樣，用無菌水梯度稀釋后(稀釋倍數(shù)為100～108)，涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)，在25℃好氧條件下培養(yǎng)72h后計(jì)數(shù)。

1.2.3 桑葚酒酒精度和糖度測(cè)定 酒精度采用酒精計(jì)法測(cè)定，參照GB/T 15038-2006;糖度計(jì)直接測(cè)定可溶性固形物含量，參照GB/T 15038-2006。

1.2.4 桑葚酒pH測(cè)定 取10mL桑葚酒液，pH計(jì)直接測(cè)定。

1.2.5 桑葚酒色度和色調(diào)的測(cè)定 采用梁冬梅［4］等的方法，略有改動(dòng)，10mL酒樣于4℃，10000×g冷凍離心30s，過濾，測(cè)其 pH，用相同 pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋n(n的數(shù)值由樣品吸光度值在準(zhǔn)確范圍內(nèi)決定)倍，然后用1cm比色皿在420、520、620nm分別測(cè)得其吸光度值。將三波長(zhǎng)下吸光度相加即為酒的色度。

1.2.6 桑葚酒總酚和總花色苷的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu’s［5］法測(cè)定。結(jié)果以等價(jià)沒食子酸表示(g gallic acid/L)。采用Lako等［6］的pH差異法測(cè)定果實(shí)總花色苷含量，結(jié)果以等價(jià)矢車菊素-3-葡萄糖苷表示(mg C3G/100mL)表示。

1.2.7 桑葚酒抗氧化活性測(cè)定

1.2.7.1 DPPH(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)自由基清除力 參照 Larrauri等［7］方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定517nm吸光度，結(jié)果按照下式計(jì)算，以清除百分率表示。

DPPH自由基清除率(%)=［1-(A1-A3)/A2］×100

式中，A1是4mL DPPH溶液加1mL酒液混合后樣液的吸光度;A2是4mL DPPH溶液加1mL乙醇混合后樣液的吸光度;A3是4mL乙醇加1mL酒液混合后樣液的吸光度。

1.2.7.2 還原力測(cè)定 準(zhǔn)確量取上清液0.1mL，以蒸餾水為空白，分別加2.5mL磷酸鈉緩沖溶液，2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后，置于50℃水浴中20min后急速冷卻。加2.5mL 10%三氯乙酸溶液，混合均勻。取5mL反應(yīng)液，加5mL蒸餾水和5mL 0.1%氯化鐵溶液，混合均勻。于700nm處測(cè)量其吸光度A。吸光度值越高表明抗氧化性越強(qiáng)。

1.2.8 光譜分析 檢測(cè)分析釀造過程中桑葚酒的透射光譜。檢測(cè)條件:0.1cm石英玻璃杯，連續(xù)掃描200～700nm UV-visible譜段，掃描間隔1nm，1600ms取樣，雙蒸水為空白。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。采用Excel數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚酒發(fā)酵過程酵母活細(xì)胞數(shù)量的變化

發(fā)酵初期，釀酒酵母對(duì)桑葚汁液適應(yīng)較快，迅速進(jìn)入繁殖階段，表現(xiàn)出較強(qiáng)的發(fā)酵動(dòng)力［8］。如圖1所示，主發(fā)酵結(jié)束，酵母細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值。隨著酒精度的升高和可利用的營(yíng)養(yǎng)素的減少，酵母活力受到抑制，發(fā)酵速度減緩，后發(fā)酵階段酵母活細(xì)胞數(shù)趨于平衡，略有減少。

圖1 桑葚酒發(fā)酵過程中酵母活細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.1 The change of yeast cell number during the fermentation of mulberry wine

2.2 桑葚酒發(fā)酵過程酒精度和糖度值的變化

酵母菌將糖發(fā)酵生成乙醇、多元醇、乙醛、乙酸和乳酸等風(fēng)味物質(zhì)。主發(fā)酵階段，由于酵母代謝旺盛，消耗大量基質(zhì)，糖度值迅速下降，酒精度持續(xù)增加。桑葚酒酒精度在發(fā)酵第6d時(shí)迅速增加達(dá)到10.65%vol(圖2)，而糖度在發(fā)酵第6d時(shí)迅速減少到6.87Brix;6d后進(jìn)入后發(fā)酵，由于產(chǎn)生的酒精在一定程度上影響了酵母菌的代謝動(dòng)力，桑葚酒糖度值趨于穩(wěn)定而酒精度略有增加，這主要由于酵母菌將糖發(fā)酵生成乙醇的過程需要經(jīng)過諸多中間環(huán)節(jié)，在糖消耗完后，酵母菌還可以將一些中間產(chǎn)物繼續(xù)轉(zhuǎn)化為乙醇。

圖2 桑葚酒發(fā)酵過程中酒精度和糖度值的變化Fig.2 The change of alcohol content and TSS during the fermentation of mulberry wine

2.3 桑葚酒發(fā)酵過程pH的變化

圖3是桑葚酒發(fā)酵過程中pH的變化情況，主發(fā)酵階段桑葚酒pH顯著下降，而后趨于穩(wěn)定，略有波動(dòng)。發(fā)酵初期，碳源供應(yīng)充分，酵母菌產(chǎn)酸量增加，桑葚酒pH下降;進(jìn)入后發(fā)酵，由于可發(fā)酵糖類含量的下降和酵母本身可吸附、絮凝一部分酸性物質(zhì)［9］，pH呈小幅波動(dòng)。

圖3 桑葚酒發(fā)酵過程中pH的變化Fig.3 The change of pH during the fermentation of mulberry wine

2.4 桑葚酒發(fā)酵過程總酚和總花色苷的變化

桑葚酒發(fā)酵過程中總酚和總花色苷含量的變化均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇有利于果肉中酚類和花色苷的溶出［1］，主發(fā)酵初期(2d)隨著酒液酒精度的增加，總酚和總花色苷含量均顯著增加，隨后由于酵母在生長(zhǎng)發(fā)酵期間對(duì)花色苷進(jìn)行了降解轉(zhuǎn)化［8］，總酚和總花色苷含量逐漸減少，花色苷的降解還與酵母在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的β 葡萄糖苷酶［10］和發(fā)酵后期酚類物質(zhì)氧化［11］有關(guān)。酚類物質(zhì)和花色苷賦予桑葚酒特殊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和色澤，縮短發(fā)酵時(shí)間有利于桑葚酒中花色苷的保留。

圖4 桑葚酒發(fā)酵過程中總酚和總花色苷的變化Fig.4 The change of total phenolic and total anthocyanin content during the fermentation of mulberry wine

2.5 桑葚酒發(fā)酵過程色度和色調(diào)的變化

色度的變化與酒樣中花色苷、單寧等酚類物質(zhì)的變化有關(guān)［10］，同時(shí)，受酒液 pH 等的影響［12］。主發(fā)酵初期，桑葚酒色度呈逐漸下降趨勢(shì)，這與酒液中花色苷等酚類物質(zhì)的積累有關(guān)，而后色度趨于穩(wěn)定，色度的損失情況與pH變化情況有關(guān)，后發(fā)酵期間pH(圖3)比較穩(wěn)定，對(duì)色度影響小。色調(diào)反映各顏色間的變化、轉(zhuǎn)移情況，發(fā)酵過程中色調(diào)值逐漸減小，色調(diào)變化與色度具有一致性，這與發(fā)酵石榴酒的變化一致［13］。

2.6 桑葚酒發(fā)酵過程抗氧化活性的變化

圖5 桑葚酒發(fā)酵過程中色度和色調(diào)的變化Fig.5 The change of color during the fermentation of mulberry wine

圖6是桑葚酒釀造過程中DPPH自由基清除率和還原力的變化情況，DPPH自由基清除率和還原力較為一致地描述了抗氧化活性的變化情況。兩指標(biāo)主發(fā)酵階段均呈現(xiàn)先升高后降低，這與主發(fā)酵期間酚類物質(zhì)和花色苷的變化一致。后發(fā)酵階段，DPPH自由基清除率和還原力逐漸增加，這與后發(fā)酵期間酚類物質(zhì)和花色苷的變化不同，這是因?yàn)橹靼l(fā)酵階段產(chǎn)生了大量的乙醇，乙醇的存在增加了酒中酚類物質(zhì)的生物活性，也提高了酚類物質(zhì)的抗氧化能力［14］。

圖6 桑葚酒發(fā)酵過程中總酚和總花色苷抗氧化活性的變化Fig.6 The change of antioxidant activity during the fermentation of mulberry wine

2.7 桑葚酒釀造過程中紫外可見掃描光譜的變化

圖7是桑葚酒發(fā)酵過程中紫外-可見吸收光譜圖，桑葚酒在280、300、360、400nm處有特征吸收峰。酚類物質(zhì)在300～400nm和240～280nm有兩個(gè)主要吸收帶，而花色苷是酚類成分，其在280nm和520nm左右有兩個(gè)特征吸收峰，花色苷的紫外吸收光譜在紫外光區(qū)有相似的吸收，但是在可見光區(qū)的差異較為明顯［15］。因此，判定280nm處是酚類和花色苷的吸收峰，300nm處的肩峰說明酒液中的花色苷具有?；?6］，360nm處是各種酚類物質(zhì)的吸收峰。本實(shí)驗(yàn)中桑葚酒的紫外可見光譜520nm處未見明顯吸收峰，500～400nm之間逐漸形成一個(gè)吸收峰，這可能是因?yàn)榫埔簆H較低，使糖基化的花色苷可見區(qū)的吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)了藍(lán)移［15］，與酚類、聚合色素等的吸收峰合并所致。

280～300nm處吸收峰峰值在主發(fā)酵階段沒有變化，進(jìn)入后發(fā)酵階段，由于果渣的分離，峰值顯著下降，整個(gè)后發(fā)酵階段，峰值維持不變。360、400nm處的吸收峰峰值在整個(gè)發(fā)酵期間均呈先增大后減小的趨勢(shì)，發(fā)酵第2d吸收峰峰值顯著增加，主發(fā)酵期間維持較高水平，進(jìn)入后發(fā)酵，吸收峰峰值逐漸降低，這與總酚和總花色苷含量的變化基本一致。

圖7 桑葚酒發(fā)酵過程中紫外可見掃描光譜的變化Fig.7 The change of UV-visible spectra during the fermentation of mulberry wine

3 結(jié)論

桑葚酒主發(fā)酵期間，酵母活細(xì)胞數(shù)量逐漸增大，酒精發(fā)酵迅速啟動(dòng)，酒液糖度、pH逐漸下降，酒精度逐漸增加，酒液色度、色調(diào)呈下降趨勢(shì)。由于主發(fā)酵期采用“浸渣”方式，果渣中抗氧化物質(zhì)被浸提出來，總酚、總花色苷含量和抗氧化能力均呈先增加后降低。

后發(fā)酵期間，酒精發(fā)酵結(jié)束，進(jìn)入蘋果酸-乳酸發(fā)酵，桑葚酒大部分理化指標(biāo)趨于穩(wěn)定。由于酚類物質(zhì)的氧化和花色苷的聚合作用，后發(fā)酵期間，總酚和總花色苷含量持續(xù)減少，由此可見，縮短發(fā)酵時(shí)間，有利于酚類物質(zhì)的保留。但是，桑葚酒中乙醇的增加，提高了酚類物質(zhì)的抗氧化能力，后發(fā)酵期間，桑葚酒抗氧化活力逐漸增大，因此，發(fā)酵34d時(shí)，桑葚酒的抗氧化活力最高。

本文描述了整個(gè)發(fā)酵期間桑葚酒的紫外可見圖譜，圖譜中特征峰的變化與總酚和總花色苷含量的變化大體一致，接下來，我們擬進(jìn)一步研究利用紫外可見掃描來判斷酒樣中抗氧化物質(zhì)的變化的可能性。

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