于瑞星 尹躍平 陳紹椿 戴秀芹 韓燕 張國(guó)毅 陳祥生

·技術(shù)與方法·

聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳用于淋球菌多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分型的評(píng)估

于瑞星 尹躍平 陳紹椿 戴秀芹 韓燕 張國(guó)毅 陳祥生

淋球菌是引起淋病的致病菌,淋球菌感染不僅可引起新生兒失明等嚴(yán)重的并發(fā)癥,還能夠加速其他病原體及HIV感染[1]。近年來(lái)淋球菌分型方法報(bào)道較多,目前最常用的是淋球菌多抗原序列分型(NG-MAST)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)分型,但這兩種分型方法費(fèi)用較高,不適合資源匱乏地區(qū)應(yīng)用。多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分型(multiple-locus variable number tandem repeat analysis,MLVA)是近年來(lái)用于淋球菌分型的一種方法,該分型方法是一種簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜、易操作、結(jié)果客觀的分型方法。本文的目的是比較聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳兩種方法進(jìn)行淋球菌MLVA分型的異同,以便選擇最佳的實(shí)驗(yàn)方法。

一、對(duì)象

10株淋球菌臨床分離菌株來(lái)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所2012年性病門診。標(biāo)本的采集及保存方法根據(jù)2007年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心下發(fā)的“全國(guó)淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)實(shí)施方案”進(jìn)行,收集淋球菌臨床分離菌株,經(jīng)初步鑒定后傳代1次,洗于脫脂牛奶中,-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。?biāo)準(zhǔn)菌株FA1090購(gòu)于北京中原公司。

主要試劑:Taq DNA 聚合酶、dNTP、MgCl2、緩沖液(不含Mg+離子)、pBR322 DNA/MspⅠ PCR參照物、 丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、10%PBS、TEMED購(gòu)于南京興生生物技術(shù)有限公司。硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、無(wú)水乙醇、冰醋酸購(gòu)于南京化學(xué)試劑廠。Tris-borate-EDTA緩沖液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

二、方法

1.淋球菌DNA的提取:將保存在-70℃冰箱的淋球菌臨床分離株復(fù)蘇,接種于淋球菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基,置于36℃5%CO2培養(yǎng)箱中過夜,挑取一滿環(huán)菌,研磨至裝有1 ml的雙蒸水中,100℃加熱10 min,1 409×g離心2 min,取上清即為DNA。

2.MLVA分型:PCR反應(yīng):依據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道,選擇7個(gè)淋球菌串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat，VNTR)基因位點(diǎn)(表1)。聚丙烯胺凝膠方法所用引物委托英濰捷基貿(mào)易有限公司合成,毛細(xì)管電泳所用引物委托上海桑尼生物科技有限公司完成,上游引物用FAM標(biāo)記。采用20 μl反應(yīng)體系,實(shí)驗(yàn)濃度分別為Taq DNA聚合酶1 U,dNTP 200 μmol/L,上游引物 0.3 μmol/L,下游引物 0.3 μmol/L,MgCl22.5 μmol/L,緩沖液體積與MgCl2相同,雙蒸水補(bǔ)充至反應(yīng)體積。VNTR264基因位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃ 30 s,68℃ 30 s,70℃ 45 s,35個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10 min。其他VNTR基因位點(diǎn) PCR反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性3 min,96℃6 s,60℃6 s,72℃10 s,40個(gè)循環(huán)。在用FAM標(biāo)記的引物PCR時(shí),注意避光。

聚丙烯酰胺凝膠電泳:VNTR264和VNTR2048基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳用6%聚丙烯酰胺凝膠,其余VNTR基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠。將上述配置成的液體混勻后快速用移液器加滿制膠板,平行放入齒梳,靜置30 min后拔掉齒梳,將2 μl樣品和1 μl溴酚藍(lán)混勻后加入加樣孔,加2 μl pBR322 DNA/MspI PCR參照物及FA1090菌株相應(yīng)VNTR基因位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物。向電泳槽中倒入1×TBE電泳緩沖液,80 V 55 min后,將聚丙烯酰胺凝膠按照文獻(xiàn)[3]方法快速銀染。

毛細(xì)管電泳:將N002-N011淋球菌臨床分離菌株及FA1090菌株全部VNTR基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物避光-20℃保存,委托上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

表1 引物序列、重復(fù)片段大小及側(cè)翼大小

FA1090 菌 株測(cè)序:FA1090 菌 株 VNTR264、VNR471、VNTR947、VNTR1609、VNTR1638、VNTR2048、VNTR218 基 因 位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序委托上海桑尼生物科技有限公司完成。

3.結(jié)果分析:在PubMed利用BLAST比對(duì),分析FA1090菌株 VNTR264、VNTR471、VNTR947、VNTR1609、VNTR1638、VNTR2048、VNTR2148基因位點(diǎn) PCR產(chǎn)物測(cè)序序列與Kushnir等[4]報(bào)道是否一致。依據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道,參照pBR322 DNA/MspⅠ PCR marker及FA1090菌株相應(yīng)VNTR基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的條帶位置,確定不同菌株VNTR基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的大小范圍;然后根據(jù)表2中不同VNTR基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物大小所對(duì)應(yīng)的重復(fù)次數(shù),確定不同菌株VNTR基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的重復(fù)次數(shù)。將上海桑尼科技有限公司毛細(xì)管電泳結(jié)果利用Peak Scanner和Gene Marker軟件分析數(shù)據(jù),確定不同VNTR基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物重復(fù)次數(shù)。

三、結(jié)果

表2 不同VNTR基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物大小所對(duì)應(yīng)的重復(fù)次數(shù)(bp)

表3 毛細(xì)管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果比較

1.FA1090測(cè)序結(jié)果:VNTR264、VNTR471、VNTR947、VNTR1609、VNTR1638、VNTR2048和 VNTR2148基因位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物測(cè)序序列與文獻(xiàn)[4]報(bào)道的序列一致,即這7對(duì)引物可用于相應(yīng)VNTR基因位點(diǎn)PCR擴(kuò)增、MLVA分型。

圖1 VNTR471 PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 1:淋球菌臨床分離菌株N008;2:標(biāo)準(zhǔn)菌株FA1090;3:標(biāo)準(zhǔn)菌株FA1090;4:淋球菌臨床分離菌株N004;5:淋球菌臨床分離菌株N002;M:標(biāo)準(zhǔn)參照物

圖2 標(biāo)準(zhǔn)菌株FA1090 VNTR471 PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖 藍(lán)色峰為FA1090菌株VNTR PCR產(chǎn)物,黃色峰為內(nèi)標(biāo)LIZ500,從左到右依次增大

圖3 VNTR947 PCR產(chǎn)物聚丙烯胺凝膠電泳圖 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1:淋球菌臨床分離菌株N003;2:淋球菌臨床分離菌株N005;3:標(biāo)準(zhǔn)菌株FA1090;4:淋球菌臨床分離菌株N004

2.毛細(xì)管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果比較:見表3。N002-N011淋球菌臨床分離菌株利用聚丙烯酰胺凝膠電泳 所 確 定 的 VNTR264、VNTR471、VNTR947、VNTR1609、VNTR1638、VNTR2048、VNTR2148 基因位點(diǎn) PCR 產(chǎn)物重復(fù)次數(shù)與毛細(xì)管電泳所得結(jié)果一致。如圖1～4,FA1090菌株VNTR471及VNTR947 PCR產(chǎn)物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳與毛細(xì)管電泳結(jié)果一致。FA1090菌株VNTR264基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳確定其重復(fù)次數(shù)為3,利用毛細(xì)管電泳不能確定其重復(fù)次數(shù),而其他6個(gè)基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物利用這兩種方法所確定的重復(fù)次數(shù)一致。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)菌株FA1090 VNTR 947引物PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖 藍(lán)色峰為FA1090菌株VNTR PCR產(chǎn)物,黃色峰為內(nèi)標(biāo)LIZ500,從左到右依次增大

四、討論

合理的抗生素治療和及時(shí)了解淋病患者的性傳播網(wǎng)絡(luò)是防治淋球菌感染的重要措施。研究報(bào)道,MLVA分型可用于研究菌株在不同地區(qū)的分布,以便確定某一地區(qū)菌株的型別特點(diǎn)及爆發(fā)的流行菌株型別[2];根據(jù)型別特點(diǎn)以確定菌株的進(jìn)化及遺傳學(xué)特點(diǎn)[4];研究不同型別在人群的分布特征[5];也可根據(jù)菌株對(duì)藥物敏感性與菌株型別的關(guān)系,及早確定菌株型別與耐藥之間的關(guān)系[2]。

MLVA分型在1990年代開始用于炭疽桿菌、土拉熱桿菌、包柔螺旋體螺旋體、大腸桿菌、結(jié)核桿菌等病原體的分子流行病學(xué)研究。淋球菌MLVA分型根據(jù)FA1090淋球菌菌株整個(gè)基因組序列,采用Tandem Repeat Finder軟件篩選出合適的串聯(lián)重復(fù)序列,通過分析菌株串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)目來(lái)分型。有研究[6-10]已經(jīng)建立了結(jié)核分枝桿菌MLVA分型方法標(biāo)準(zhǔn)化操作。MLVA分型可采用基因測(cè)序、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳3種實(shí)驗(yàn)方法。前兩種實(shí)驗(yàn)方法在文獻(xiàn)中已經(jīng)有報(bào)道用于MLVA分型[2-5]。毛細(xì)管電泳結(jié)果與聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果對(duì)比,具有一致性,說明毛細(xì)管電泳可用于MLVA分型。毛細(xì)管電泳是一種省時(shí)省力的實(shí)驗(yàn)方法,與測(cè)序比較,價(jià)格便宜,PCR濃度要求低;與聚丙烯酰胺凝膠電泳比較,操作簡(jiǎn)單,省時(shí)省力,有利于大樣本分子流行病學(xué)的研究。綜上所述,毛細(xì)管電泳是進(jìn)行MLVA分型較好的實(shí)驗(yàn)方法,但該實(shí)驗(yàn)方法也有一定的局限性,例如引物需要避光保存,對(duì)500 bp以上VNTR準(zhǔn)確性低。

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2014-02-20)

(本文編輯:吳曉初)

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.021

國(guó)家自然科學(xué)基金(81101294);國(guó)家十一五科技重大專項(xiàng)(2008ZX10001-005)

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尹躍平,Email:yinyp@ncstdlc.org