馬長(zhǎng)沙,段成軍,馬靜潔

(延邊大學(xué),吉林延吉133000)

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide,AHL)為爵床科植物穿心蓮干燥地上部分[Andrographis paniculata(Burm.f)Nees]中提取得到的二萜內(nèi)酯類化合物,是中藥穿心蓮的主要有效成分之一。穿心蓮內(nèi)酯具有廣泛的藥理活性,具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、治療心腦血管疾病等多種藥理作用。但其水溶性較差,影響其制劑的發(fā)展。對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,增強(qiáng)其活性及水中溶解性,利用Michael加成、羥基上的反應(yīng)、分子內(nèi)環(huán)化、分子內(nèi)酯環(huán)化等反應(yīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到了穿心蓮內(nèi)酯衍生物。筆者對(duì)穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的研究進(jìn)展進(jìn)行概述,為穿心蓮內(nèi)酯今后的研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 理化性質(zhì)

穿心蓮內(nèi)酯(C20H30O5)為萜內(nèi)酯類化合物,結(jié)構(gòu)式見圖1。化學(xué)名:(3E,4S)-3-[2-[(1R,4aS,5R,6R,8aS)-decahydro-6-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-5,8a-dimethyl-2-methylene-1-naphthalenyl]ethylidene dihydro-4-hydroxy-2(3H)-furanone。白色方棱形或片狀結(jié)晶(乙醇或甲醇),無臭,味苦。穿心蓮內(nèi)酯在水相中的溶解度非常低,在油相中的溶解度較高,屬于脂溶性很強(qiáng)的藥物,但水中溶解度隨著外界溫度的升高而增大[1]。在沸乙醇中溶解,在甲醇或乙醇中略溶,極微溶于氯仿,在水或乙醚中幾乎不溶。熔點(diǎn)230～231 ℃,(α)17D-126.6 ±2°(C=1.5,冰醋酸),[α]D-112.7(C=0.53,MeOH)。

圖1 結(jié)構(gòu)式

2 提取分離

從穿心蓮莖葉中提取穿心蓮內(nèi)酯的方法很多,主要有水提法、醇提法、堿水法和酸水法,這些方法同時(shí)輔以超聲波,可顯著縮短浸提時(shí)間,明顯加快溶出效率,提高內(nèi)酯的浸出率,保證其穩(wěn)定性。趙玉江等[2]以穿心蓮內(nèi)酯為考察指標(biāo),以HPLC法測(cè)定水提法、醇提法和堿水法對(duì)穿心蓮內(nèi)酯濃度及出膏率的影響,結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯濃度以醇提法及0.01%堿水提取為佳,濃度分別為4.43%和4.31%,但出膏率 0.01%堿水較高,達(dá)24.08%。周一君[3]采用乙醇等溶劑冷浸、熱浸或滲漉等方法提取穿心蓮莖葉中的穿心蓮內(nèi)酯,回收乙醇,經(jīng)過一系列處理得到穿心蓮總內(nèi)酯,將其以三氯甲烷或二氯甲烷冷溶2～4次,過濾,得到濾液與不溶物,濾液可分離得到脫水穿心蓮內(nèi)酯與去氧穿心蓮內(nèi)酯純品。不溶物經(jīng)溶劑分離可得到新穿心蓮內(nèi)酯及和穿心蓮內(nèi)酯純品。

吳俊偉等[4]根據(jù)穿心蓮內(nèi)酯可以同亞硫酸氫鈉起加成反應(yīng)的原理,設(shè)計(jì)了酸水法提取穿心蓮內(nèi)酯的方法,并與乙醇回流法、堿水法、乙醇冷浸法、冷水浸漬法等方法比較,結(jié)果顯示此方法與乙醇回流法對(duì)穿心蓮內(nèi)酯的提取效果相同,且好于其他方法。馬芝玉等[5]用正交法對(duì)微波和超聲波輔助提取穿心蓮內(nèi)酯的工藝條件進(jìn)行對(duì)比,篩選出微波和超聲波輔助提取法的最佳工藝,并對(duì)2種提取方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明:與超聲波提取法相比,微波提取法提取時(shí)間較短,提取率較高。彭夢(mèng)微等[6]對(duì)減壓沸騰法提取穿心蓮內(nèi)酯的工藝進(jìn)行研究,得出結(jié)論,此方法由于在較低溫度下快速操作完成,抑制了雜質(zhì)的溶出,且收率較高。并得出了減壓沸騰法提取穿心蓮的最佳工藝:提取劑濃度32%,提取溫度59℃。此條件下穿心蓮的最大收率為0.662%。

3 穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的藥理作用

穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物除了具有清熱解毒,涼血消腫的功效外,還具有抗菌、抗炎、治療心腦血管疾病、免疫增強(qiáng)、抗腫瘤等多種藥理作用。

3.1 抗菌作用 Wang Zhongli[7]通過用不同的取代側(cè)鏈取代穿心蓮內(nèi)酯的C-14位羥基,發(fā)生縮合反應(yīng)合成穿心蓮內(nèi)酯的一系列衍生物。合成的一系列新穿心蓮內(nèi)酯衍生物都是信號(hào)分子AHLs(acyl homoserine lactones)類似物,并且有較強(qiáng)的抗菌活性。細(xì)菌通過不同信號(hào)分子相互通信,每種細(xì)菌產(chǎn)生少量的一種或多種信號(hào)分子,并釋放到內(nèi)壞境中,當(dāng)達(dá)到一定的臨界值時(shí),就會(huì)促進(jìn)細(xì)菌群體效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄,這種依靠細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞發(fā)生的群體現(xiàn)象叫做群體效應(yīng)(QS)。QS控制次生代謝產(chǎn)物,生物發(fā)光,蛋白的分泌,毒力因子的產(chǎn)生,質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和細(xì)菌生物膜的形成。在實(shí)驗(yàn)中以革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)為例來研究細(xì)菌QS和細(xì)菌生物膜的形成。實(shí)驗(yàn)證明,其中的一些化合物,如R-(a)-lipoic acid和穿心蓮內(nèi)酯的結(jié)合物,顯著影響銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)并抑制生物膜的形成。實(shí)驗(yàn)得出新化合物的活性比較結(jié)果。新化合物的SAR分析發(fā)現(xiàn):1)在天然穿心蓮內(nèi)酯C-14位引入脂族側(cè)鏈(直鏈或環(huán)狀的),可增加其抑制毒力因子產(chǎn)生的活性;2)有些化合物顯著抑制蛋白酶的產(chǎn)生,但是抑制綠膿素產(chǎn)生方面作用較差,表明該化合物通過不同的途徑抑制這兩個(gè)毒力因子的產(chǎn)生;3)有些化合物同時(shí)有效抑制綠膿素和蛋白酶的產(chǎn)生,這些結(jié)果之間的差異有待進(jìn)一步研究;4)結(jié)果表明,無論化合物是否含有二硫鍵,同樣可以有效的抑制綠膿菌素和蛋白酶產(chǎn)生,表明二硫鍵在發(fā)揮抗菌活性方面的作用并不顯著。而且有些化合物除了具有抗菌和抗病毒活性外,在體外和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中還表現(xiàn)出顯著的抗糖尿病活性。這些結(jié)果表明,二硫鍵在抗糖尿病方面起著至關(guān)重要的作用。并且AL-1的抗菌和抗糖尿病的機(jī)制是不同的。Uthaiwan Sirion[8]發(fā)現(xiàn)在穿心蓮內(nèi)酯C-19位置上用乙酰基,甲硅烷基和三苯基甲基醚基團(tuán)修飾,可得到抗菌活性較高的穿心蓮內(nèi)酯衍生物,并比較了其抗菌活性。

3.2 解熱抗炎作用 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)肺炎雙球菌和溶血性乙型鏈球菌引起的體溫升高和傷寒、副傷寒菌苗所致的發(fā)熱有一定的解熱作用,對(duì)同時(shí)感染肺炎雙球菌和溶血性鏈球菌培養(yǎng)物的家兔有延緩體溫上升時(shí)間的作用,并且減緩了體溫上升的程度。對(duì)于2,4-二硝基酚或內(nèi)毒素誘導(dǎo)的發(fā)熱和蛋清誘導(dǎo)的水腫或巴豆油誘導(dǎo)的炎癥模型,穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯(NA)、脫氧穿心蓮內(nèi)酯(DA)和脫氧二脫氫穿心蓮內(nèi)酯(DDA)的退熱、抗炎活性強(qiáng)度依次為DDA、DA、NA和穿心蓮內(nèi)酯。對(duì)于干酵母所致的大鼠發(fā)熱及內(nèi)毒素所致的家兔發(fā)熱,脫氧穿心蓮內(nèi)酯磷酰化鈉(DAP Na)(300,150 mg/kg)有良好的解熱作用;400,200,100 mg/kg DAPNa對(duì)蛋清所致的大鼠足腫脹及二甲苯所致的小鼠耳腫脹均有良好抗炎作用[9]。史傳英等[10]研究表明亞硫酸鈉穿心蓮內(nèi)酯具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用,實(shí)驗(yàn)表明亞硫酸鈉穿心蓮內(nèi)酯對(duì)大腸桿菌誘發(fā)的家兔發(fā)熱有顯著降溫作用。在鎮(zhèn)痛作用方面,亞硫酸鈉穿心蓮內(nèi)酯可顯著延長(zhǎng)小鼠的舔足反應(yīng)潛伏期,可減少冰醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)?？寡鬃饔梅矫鎭喠蛩徕c穿心蓮內(nèi)酯可明顯抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹。O’Shea JJ[11]研究表明,炎癥的發(fā)生與巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的激活、TNF-α,白介素1(IL-1),白介素6(IL-6),干擾素-γ(IFN-γ),NO 和細(xì)胞黏附分子等炎性介質(zhì)的釋放有關(guān)。研究表明,穿心蓮內(nèi)酯能影響一氧化氮合成酶的表達(dá),抑從而制NO的產(chǎn)生,抑制巨噬細(xì)胞的遷移和TNF-α,白介素12(IL-12)的產(chǎn)生[12-14]。炎癥反應(yīng)時(shí),黏附分子表達(dá)上調(diào)及內(nèi)皮-白細(xì)胞黏附增加。體外實(shí)驗(yàn)表明,脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸單鉀鹽可直接破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu),并抑制大量炎性因子如腫瘤壞死因子-A(TNFA)、白介素-1和-6(IL-1,IL-6)的活性,從而拮抗內(nèi)毒素的作用[15]。Tsai等[16]闡述了穿心蓮內(nèi)酯作用于體外補(bǔ)體5α(C5α)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞補(bǔ)充的抗炎機(jī)制,得出穿心蓮內(nèi)酯抗炎作用的機(jī)理可能是通過摻入ERK 1/2和PI3K/Akt信號(hào)通路的細(xì)胞分裂抑制作用的結(jié)論。

過去的研究表明,穿心蓮乙酸乙酯部分(AP)具有抗炎活性。CHAO Wenwan等[17]通過生物色譜法進(jìn)一步分離這些活性化合物,并確定了8個(gè)純化合物。實(shí)驗(yàn)表明5-羥基-7,8-二甲氧基黃酮,5-羥基-7,8-二甲氧基二氫黃酮,混合的β-谷甾醇和豆甾醇,麥角甾醇過氧化物,14-去氧-14,15-脫氫穿心蓮內(nèi)酯,和一種新的化合物19-O-乙?；?14-脫氧-11,12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯,都顯著抑制LPS/IFN-γ中的轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B的活性,NF-κ B可激活RAW 264.7巨噬細(xì)胞(P<0.05)。2個(gè)最豐富的化合物,14-去氧-11,12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯抑制活性較小,但經(jīng)過還原,氧化,或乙酰化后會(huì)得到抑制活性增加的4種衍生的化合物。所得的化合物能夠顯著降低TNF-R,IL-6,巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(MIP-2),和LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的 RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)分泌物,并且比較了化合物對(duì) RAW 264.7細(xì)胞的NF-κ B的抑制作用強(qiáng)弱。

3.3 心血管系統(tǒng) Chen等[18]調(diào)查了穿心蓮內(nèi)酯保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVESVCs)免受生長(zhǎng)因子(GF)缺乏誘導(dǎo)的凋亡的分子機(jī)理和信號(hào)通路。研究表明穿心蓮內(nèi)酯在HUVESVCs中通過激活A(yù)kt-BAD通路發(fā)揮其抗凋亡作用。Burgos等[19]發(fā)現(xiàn)14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯有Ca2+離子通道阻斷活性。研究還發(fā)現(xiàn)DA還是一種牛嗜中性粒細(xì)胞PAF介導(dǎo)過程的有效拮抗劑。以上研究表明穿心蓮及其衍生物具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。穿心蓮及其衍生物還具有降壓作用。Zhang等研究認(rèn)為降低血壓的機(jī)制是DA和DDA能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增加NO的釋放量,從而激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶而起到擴(kuò)張血管的作用[20]。

3.4 免疫調(diào)節(jié) 穿心蓮內(nèi)酯,是一種非特異性免疫刺激劑,能夠促進(jìn)免疫活性細(xì)胞增殖,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用和游走指數(shù),并通過影響NK、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞因子分泌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[21]。據(jù)Anju Puri等[22]報(bào)道,通過對(duì)比穿心蓮內(nèi)酯乙醇提取物和穿心蓮內(nèi)酯刺激抗原的特異性和非特異性免疫反應(yīng),得出穿心蓮乙醇提取物中存在其他的免疫物的結(jié)論。

Wang Bin[23]合成了一系列的穿心蓮內(nèi)酯衍生物,并且評(píng)估潛在的體外抗-HIV活性。與穿心蓮內(nèi)酯相比,一些衍生物具有更好的抗HIV-1活性。在C-3和C-19羥基引入二芳基的衍生物比在C-3或C-9引入烷基的衍生物表現(xiàn)出更高的TI值,而在C-3和C-19引入過大的芳基會(huì)影響抑制活性的CPE和TI。在CFDA和美國(guó)FDA的相關(guān)法規(guī)指導(dǎo)下,TI被認(rèn)為是體外抗HIV活性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo),TI在10以上的化合物在體外具有抗-HIV作用。

3.5 抗腫瘤作用 近年來,研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮中重要的二萜內(nèi)酯類化合物穿心蓮內(nèi)酯在許多體內(nèi)外模型上表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的抗腫瘤作用[24-26],如可抑制人急性早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)增殖,阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。DA和DDA是穿心蓮中2種重要的二萜內(nèi)酯類有效成分,DA在Ec9706和A549上表現(xiàn)出的增殖抑制活性均顯著強(qiáng)于DDA,與文獻(xiàn)報(bào)道在其他細(xì)胞株上的結(jié)果一致[28]。有研究表明[29]在穿心蓮內(nèi)酯C-3,19引入縮醛(酮)基可顯著提高其體外抗腫瘤活性。其中引入鹵代苯基的衍生物活性提高幅度最大,DA的C-14羥基單獨(dú)乙?；cC-14,19羥基同時(shí)乙?；a(chǎn)物的活性相當(dāng),且都強(qiáng)于DA;DA的C-3,C-14,C-19 3個(gè)羥基同時(shí)乙?；纱蠓岣咂鋵?duì)Ec9706的增殖抑制活性。DA的C-8,17雙鍵環(huán)氧化后活性提高,與Nanduri等[30]在卵巢癌SKOV3上的結(jié)果一致。在DDA的C-15取代衍生物中,當(dāng)為脂肪族衍生物時(shí),剛性越強(qiáng)越不利于活性發(fā)揮;當(dāng)為芳香族衍生物時(shí),共軛體系和剛性的引入也不利于活性的發(fā)揮,而當(dāng)取代基為4-氟代苯基時(shí),可能苯基上強(qiáng)電負(fù)性元素可以緩解C-15取代后導(dǎo)致的活性下降,另外苯環(huán)上含有羥基也可部分提高活性。

Uthaiwan Sirion[8]的研究發(fā)現(xiàn)新的C-19取代穿心蓮內(nèi)酯類似物具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮的主要二萜類內(nèi)酯,對(duì)癌細(xì)胞有毒。他們研究了通過改變3個(gè)羥基組得到的一系列衍生物的構(gòu)效關(guān)系。穿心蓮內(nèi)酯類似物比母體化合物對(duì)癌細(xì)胞的的細(xì)胞毒活性高得多,包括對(duì)P-388,KB,COL-2,MCF-7,LU-1和ASK癌細(xì)胞對(duì)的細(xì)胞毒性。通過對(duì)穿心蓮內(nèi)酯合成類似物的研究表明,在母體化合物的C-19引入甲硅烷基醚或三苯基甲基醚可增加對(duì)癌細(xì)胞的毒性。19-O-三苯甲基醚衍生物比有效的抗癌藥物玫瑰樹堿細(xì)胞毒活性高,因此,此類似物可以作為一個(gè)新的抗癌藥物的潛在發(fā)展結(jié)構(gòu)。過去的研究也證明含有三笨甲基的化合物具有抗癌活性。研究得知無論在C-3還是C-14位引入乙?；?其活性均可增加,但是引入乙酰基的位置對(duì)其活性無影響。但是在C-3和C-14位都引入乙酰基會(huì)降低其活性。

Bimolendu Das[31]通過C-14位羥基的化學(xué)選擇性功能制備出一系列的穿心蓮內(nèi)酯類似物,在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)人白血病細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)表明穿心蓮內(nèi)酯衍生物都表現(xiàn)出很強(qiáng)的藥效,構(gòu)效關(guān)系的初步研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯α-次甲基-γ-丁內(nèi)酯在活性譜中發(fā)揮了重要作用。并通過光譜和資料分析,建立了類似物的結(jié)構(gòu)。穿心蓮內(nèi)酯1包含(a)兩個(gè)雙鍵的(△12及△8(17)),(b)α-次甲基-γ-丁內(nèi)酯,及(c)C3,C-14,和C19位的3個(gè)羥基。由于C-14位的羥基具有選擇性功能,因此選擇了C-14位。實(shí)驗(yàn)證明穿心蓮內(nèi)酯轉(zhuǎn)變?yōu)檫m當(dāng)?shù)难苌秕?C-14)能夠增加其溶解度以及活性,酯酶切割酯鍵后能夠在體內(nèi)生理?xiàng)l件下釋放穿心蓮內(nèi)酯,該酯類似物可作為一種前藥?；谶@個(gè)目的合成了在C-14位修飾的穿心蓮內(nèi)酯酯類衍生物。衍生物構(gòu)效關(guān)系(SAR)的研究表明,主要發(fā)揮作用的是α-次甲基-γ-丁內(nèi)酯基團(tuán)。

4 結(jié)論

近年來隨著對(duì)穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物藥理活性研究的不斷深入,進(jìn)一步證明穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物具有廣泛的藥理活性,并展示出了廣闊的深入開發(fā)的應(yīng)用前景。但穿心蓮內(nèi)酯生物利用度低,和大部分中藥有效成分一樣,具有多種藥理作用,但活性都不明顯。因此開發(fā)新劑型并用化學(xué)方法制備穿心蓮內(nèi)酯衍生物是解決生物利用度低、增強(qiáng)臨床療效的重要途徑。許多穿心蓮內(nèi)酯衍生物被發(fā)現(xiàn)有較好的抗腫瘤、抗炎等生物活性,對(duì)進(jìn)一步以穿心蓮內(nèi)酯為先導(dǎo)的新藥研發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

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