楊圣菊 孟國(guó)梁 顧黎雄 王建力

糖尿病小鼠皮膚組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物的表達(dá)及其對(duì)膠原纖維的影響

楊圣菊 孟國(guó)梁 顧黎雄 王建力

目的觀察不同病程糖尿病小鼠皮膚組織晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）的表達(dá)及其對(duì)膠原纖維的影響。方法健康8周齡C57BL/6J雄性小鼠采用小劑量鏈佐星（50 mg/kg）多次注射法建立糖尿病模型，分別在造模后第4周和12周處死小鼠，取背部中央皮膚，HE染色觀察組織學(xué)結(jié)構(gòu)，樣本堿水解法測(cè)定羥脯氨酸水平反映膠原總量，限制性胃蛋白酶降解法測(cè)定膠原交聯(lián)程度，實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原基因表達(dá)，熒光分光光度法和Western印跡檢測(cè)晚期糖基化終末產(chǎn)物水平，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。結(jié)果鏡下可見(jiàn)糖尿病小鼠皮膚組織明顯變薄，膠原呈進(jìn)行性減少。第4周和12周時(shí)，糖尿病組小鼠皮膚組織羥脯氨酸含量與正常對(duì)照組比較顯著降低[（684.5±76.7）比（787.7±87.7）mg/g，（558.1±73.1）比（757.8±75.3）mg/g，均P＜0.01]，皮膚AGE水平顯著上升[（37.47±10.65）比（26.39±3.74）AUF/mg羥脯氨酸，（47.70±5.66）比（29.91±6.50）AUF/mg羥脯氨酸，均P＜0.01]，丙二醛含量顯著增加[（6.62±0.47）比（4.82± 0.56） μmol/L，（8.63± 0.36）比（5.15± 0.46） μmol/L，均P＜ 0.01]，交聯(lián)膠原以及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)均下降（P＜0.01或0.05），糖尿病12周組非交聯(lián)膠原亦明顯下降（P＜0.05）；與糖尿病4周組相比，糖尿病12周組小鼠皮膚羥脯氨酸含量、Ⅰ型膠原表達(dá)進(jìn)一步減少（P＜0.05），AGE和丙二醛水平進(jìn)一步增加（P＜0.01）。結(jié)論糖尿病小鼠皮膚組織膠原纖維性狀發(fā)生改變，可能與皮膚組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物水平上升及氧化損傷加劇有關(guān)。

皮膚；糖尿?。荒z原Ⅰ型；膠原Ⅲ型；糖基化終產(chǎn)物，高級(jí)

皮膚病變是糖尿病患者常見(jiàn)并發(fā)癥之一，國(guó)內(nèi)外報(bào)道約30%的糖尿病患者合并皮膚損害,如果同時(shí)考慮代謝和微循環(huán)障礙，幾乎所有糖尿病患者均有皮膚受累。該病變?cè)缙谧铒@著的變化為真皮內(nèi)膠原纖維減少［1］，而皮膚膠原纖維性狀的另外兩個(gè)重要特征膠原交聯(lián)程度和膠原纖維類(lèi)型是否發(fā)生明顯改變尚不清楚。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGE）表達(dá)增加與人瘢痕疙瘩組織中纖維增生關(guān)系密切［2］。AGE可使膠原蛋白可溶性下降，進(jìn)而造成皮膚膠原纖維性狀發(fā)生改變。本研究擬通過(guò)分析不同病程糖尿病小鼠皮膚組織中AGE的表達(dá)，初步探討其對(duì)皮膚組織膠原纖維的影響與意義。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常健康8周齡C57BL/6J雄性小鼠60只，體重20～30 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2008-0010。

二、主要試劑與儀器

鏈佐星（streptozotocin，美國(guó)Sigma-Aldrich公司），胃蛋白酶（美國(guó)BBI公司），羥脯氨酸測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所），總RNA提取試劑盒（RNAiso Plus）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）、Bulk（日本 TaKaRa 公司），丙二醛測(cè)試盒、放射免疫沉淀法（RIPA）組織裂解液（海門(mén)碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗小鼠AGE抗體（英國(guó)Abcam公司），兔抗小鼠磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，上海康成生物工程有限公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（武漢博士德生物科技有限公司）。血糖測(cè)量?jī)x及測(cè)量試紙（美國(guó)Johnson&Johnson公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），熒光分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物處理與分組：將60只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病組，禁食（不禁水）14～16 h后，糖尿病組（40只）腹腔注射鏈佐星50 mg/kg（臨用前以0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解），對(duì)照組（20只）腹腔注射等量0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液，連續(xù)5 d，間隔1周后取尾靜脈血測(cè)空腹血糖，＞11.1 mmol/L為糖尿病造模成功，并定期監(jiān)測(cè)血糖水平［3］。取糖尿病成模小鼠20只隨機(jī)分為兩組，每組10只，然后分別在鏈佐星末次注射4周（糖尿病4周組）和12周（糖尿病12周組）后，用硫化鋇脫毛劑（硫化鋇∶滑石粉∶洗衣粉 =2∶2∶1）脫去背部鼠毛后處死小鼠，取鼠背部中央約2 cm×2 cm的全層皮膚標(biāo)本，用4%中性甲醛固定，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察皮膚組織學(xué)改變；背部余下皮膚液氮凍存后置-80℃冰箱備用。對(duì)照組在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)各取10只小鼠進(jìn)行相同檢測(cè)。

2.羥脯氨酸含量檢測(cè)：按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,采用樣本堿水解法測(cè)定皮膚組織中羥脯氨酸含量。

3.膠原交聯(lián)程度檢測(cè)：采用限制性胃蛋白酶降解法分別測(cè)量皮膚組織中非交聯(lián)膠原（non-crosslinked collagen）及交聯(lián)膠原（cross-linked collagen），計(jì)算交聯(lián)與非交聯(lián)膠原的含量，并以?xún)烧弑戎捣从衬z原交聯(lián)程度［4］。

4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)皮膚組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)：取約100 mg皮膚組織，加入1 ml RNAiso Plus充分勻漿后，提取總RNA。取500 ng RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后以cDNA為模板，對(duì)皮膚組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：SYBR?預(yù)混液10 μl，上下游引物（5 nmol/L）各 1 μl，雙蒸水 6 μl，cDNA樣品2 μl，反應(yīng)結(jié)束后讀取閾值循環(huán)數(shù)Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，用△△Ct法分析目的基因mRNA表達(dá)量。引物信息如下：Ⅰ型膠原，上游5′-ATCTCCTGGTGCTGATGGAC-3′，下游 5′-ACCTTG TTTGCCAGGTTCAC-3′；Ⅲ型膠原，上游 5′-AAACT GGTGAACGTGGCTATG-3′，下游 5′-TTTTCACCTC CAACTCCAACAATG-3′；GAPDH，上游 5′-GGTGAA GGTCGGTGTGAACG-3′，下游 5′-CTCGCTCCTGGA AGATGGTG-3′。

5.AGE測(cè)定：皮膚組織按100 mg∶1 ml比例加入磷酸鹽緩沖液（PBS）勻漿后，應(yīng)用熒光分光光度計(jì)測(cè)定組織勻漿中AGE熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)為370 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為440 nm，狹縫間隙3 nm，直接測(cè)定熒光強(qiáng)度。AGE含量用皮膚羥脯酸含量校正后表示為每毫克羥脯氨酸所含熒光強(qiáng)度（AUF）［4］。另取皮膚組織按100 mg∶1 ml比例加入RIPA組織裂解液（含蛋白酶抑制劑），勻漿提取蛋白，2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（BCA）法測(cè)定蛋白濃度。然后取各樣本蛋白質(zhì)50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離（濃縮膠5%，分離膠10%），轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，室溫下5%脫脂奶粉封閉 2 h，分別加入 AGE（1∶1 000）及GAPDH抗體（1∶6 000）4℃孵育過(guò)夜，充分洗滌后，在膜的正面滴加含有相應(yīng)二抗的封閉液，室溫?fù)u床反應(yīng)2 h，ECL法顯影。

6.丙二醛測(cè)定：按試劑盒說(shuō)明，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定皮膚組織中丙二醛含量。

結(jié) 果

一、血糖檢測(cè)

鏈佐星注射造模后，小鼠出現(xiàn)一定程度的體重下降、飲水增多、多尿等癥狀。血糖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鏈佐星造模組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間血糖水平均高于11.1 mmol/L，其中注射鏈佐星4周和12周后糖尿病組小鼠空腹血糖分別為（18.3±2.9）mmol/L和（15.7±3.0）mmol/L，與同周齡對(duì)照組相比明顯升高[（4.4±0.6）mmol/L和（4.5±0.5）mmol/L，均P＜0.01]，提示糖尿病小鼠造模成功。

二、組織學(xué)檢測(cè)

對(duì)照組皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞層次清晰,真皮內(nèi)膠原排列規(guī)則；糖尿病組表皮變薄，角質(zhì)形成細(xì)胞減少，局部為單層排列,真皮層厚度較對(duì)照組減少，排列相對(duì)致密，皮下脂肪萎縮，且隨病程延長(zhǎng)進(jìn)一步加重（圖 1）。

三、皮膚組織膠原纖維性狀分析

見(jiàn)表1。糖尿病組建模4周及12周后，小鼠皮膚組織總羥脯氨酸含量與同周齡對(duì)照組相比均出現(xiàn)明顯下降（P值分別 ＜0.05，0.01），且糖尿病12周組較4周組亦有一定程度的降低（t=3.77，P＜0.01）。與同周齡對(duì)照組相比，糖尿病4周組和12周組小鼠皮膚組織中交聯(lián)膠原下降明顯（均P＜0.01），且糖尿病12周組與4周組相比亦顯著降低（t=2.92，P＜0.05）。值得注意的是，與同周齡對(duì)照組相比，糖尿病組小鼠4周組和12周組皮膚交聯(lián)膠原與非交聯(lián)膠原比值均明顯下降（P＜0.05）。

糖尿病4周及12周組小鼠皮膚組織中Ⅰ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為（0.36±0.11）和（0.13±0.06），與同周齡對(duì)照組（分別為0.97±0.37和1.02±0.52）相比明顯下降（t值分別為3.83和4.22，均P＜0.01）；Ⅲ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為（0.19±0.09）和（0.10±0.05），較同周齡對(duì)照組（分別為1.10±0.50和0.66±0.21）亦明顯下降（t分別為4.40和6.36，均P＜0.01）；與糖尿病組4周時(shí)相比，12周組Ⅰ型膠原表達(dá)進(jìn)一步下降（t=4.35，P＜ 0.01）。

圖1 小鼠背部中央皮膚組織HE染色（標(biāo)尺：100 μm）1a：對(duì)照組注射枸櫞酸緩沖液4周后，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮內(nèi)膠原層次清晰，排列規(guī)則，皮下脂肪層正常；1b：糖尿病組建模4周后：表皮和真皮層變薄，皮下脂肪萎縮；1c：對(duì)照組注射枸櫞酸緩沖液12周后，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮內(nèi)膠原稍有減少，但層次清晰，排列規(guī)則，皮下脂肪層無(wú)明顯異常；1d：糖尿病組建模12周后，表皮和真皮層明顯變薄，皮下脂肪大量萎縮

表1 不同病程糖尿病小鼠皮膚組織中總羥脯氨酸、交聯(lián)膠原和非交聯(lián)膠原中羥脯氨酸含量（±s）

表1 不同病程糖尿病小鼠皮膚組織中總羥脯氨酸、交聯(lián)膠原和非交聯(lián)膠原中羥脯氨酸含量（±s）

注：t值為同周齡對(duì)照組與糖尿病組相比

4周組別 只數(shù)交聯(lián)膠原/非交聯(lián)膠原對(duì)照組 10 787.7±87.7 472.2±67.4 315.5±45.4 1.5±0.3 757.8±75.3 433.6±76.3 324.2±36.1 1.2±0.2糖尿病組 10 684.5±76.7 375.8±65.8 308.7±26.3 1.4±0.3 558.1±73.1 282.8±76.3 275.3±41.1 1.0±0.3 t值 2.80 3.24 0.41 2.55 6.02 4.42 2.83 2.74 P值 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 12周總羥脯氨酸（mg/g）交聯(lián)膠原中羥脯氨酸（mg/g）非交聯(lián)膠原中羥脯氨酸（mg/g）交聯(lián)膠原/非交聯(lián)膠原總羥脯氨酸（mg/g）交聯(lián)膠原中羥脯氨酸（mg/g）非交聯(lián)膠原中羥脯氨酸（mg/g）

四、皮膚組織中AGE水平

熒光分光光度法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（表2），與同周齡對(duì)照組相比，糖尿病小鼠皮膚組織中AGE含量明顯增加（P＜0.01），糖尿病12周組較4周組上升（t=2.68，P＜0.05）。蛋白印跡檢測(cè)亦有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)（圖2，表2），糖尿病4周和12周組皮膚組織中AGE蛋白表達(dá)水平均較同周齡對(duì)照組明顯增加（均P＜0.01），糖尿病12周組較4周組進(jìn)一步增加（t=4.60，P＜ 0.01）。

五、皮膚組織中丙二醛水平

糖尿病組4周及12周時(shí)皮膚組織中丙二醛水平均明顯高于同周齡對(duì)照組（均P＜0.01），糖尿病組12周組較4周組明顯增加（t=10.69，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

討 論

膠原中羥脯氨酸的含量較穩(wěn)定，約占膠原蛋白總量的13.4%，故測(cè)定皮膚組織羥脯氨酸的含量便可計(jì)算出膠原的含量［5］。本研究結(jié)果表明，不同周齡的糖尿病小鼠皮膚組織羥脯氨酸含量出現(xiàn)明顯下降，并伴有不同程度的皮膚全層變薄、皮下脂肪進(jìn)行性萎縮、真皮層膠原纖維減少且排列致密，這可能是糖尿病機(jī)體皮膚變薄及彈性變差的病理學(xué)基礎(chǔ)。

圖2 Western印跡檢測(cè)小鼠皮膚組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）水平 1、3：分別為對(duì)照組注射枸櫞酸緩沖液4周和12周后；2、4：分別為糖尿病組建模4周和12周后

皮膚膠原纖維性狀尚包括皮膚膠原交聯(lián)程度。交聯(lián)后的膠原分子理化性質(zhì)和生物學(xué)性能均發(fā)生變化，變得僵硬，不容易溶解和被蛋白酶降解，從而使含有膠原的基質(zhì)蓄積，成為皮膚纖維增生性疾病的重要誘發(fā)因素之一；另一方面，膠原交聯(lián)有利于膠原纖維聚積，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)與愈合［6］。在糖尿病小鼠皮膚組織中，我們發(fā)現(xiàn)膠原纖維交聯(lián)程度明顯下降，提示皮膚存在著膠原交聯(lián)的障礙，不利于糖尿病皮膚組織的創(chuàng)面修復(fù)，糖尿病病程越長(zhǎng)，這一現(xiàn)象越嚴(yán)重。另外，皮膚組織主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成，其中Ⅰ型膠原彈性小、張力較大，Ⅲ型膠原彈性較好，兩者和其他間質(zhì)一起形成復(fù)雜的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在維持皮膚正常結(jié)構(gòu)和功能完整性等方面起著非常重要的作用［7-8］。我們發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠皮膚組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)均明顯下降，這可能與膠原纖維總量水平相對(duì)較低有關(guān)，但Ⅰ型膠原和Ⅲ膠原纖維的比例并未產(chǎn)生明顯變化。

目前認(rèn)為，AGE對(duì)皮膚膠原纖維具有雙向作用［2,9-10］。一方面，AGE可通過(guò)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、Smad蛋白等介導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)沉著，甚至造成皮膚膠原纖維增生性疾病（如瘢痕疙瘩、系統(tǒng)性硬化病等）的發(fā)生［9］；另一方面，AGE 可通過(guò)激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)一步引起caspase-3活化，從而造成皮膚成纖維細(xì)胞凋亡，阻礙皮膚創(chuàng)傷愈合［10］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠皮膚組織中AGE水平明顯高于對(duì)照組，丙二醛水平明顯升高，這可能是由于皮膚真皮層和微血管壁細(xì)胞間基質(zhì)含有大量的膠原纖維，賴(lài)氨酸和羥基賴(lài)氨酸含量豐富，是糖基化的好發(fā)部位［11］；在糖尿病慢性高血糖作用下，膠原蛋白極易發(fā)生糖基化修飾，從而造成皮膚組織中AGE產(chǎn)生增多并形成惡性循環(huán)［12］；AGE再作用于其受體，引起活性氧簇產(chǎn)生增加，升高自由基，造成氧化損傷［13］，引起膠原纖維變性和壞死。同時(shí)，膠原纖維作為皮膚組織主要的細(xì)胞成分，高血糖及AGE等毒性物質(zhì)持續(xù)作用，可直接改變膠原纖維空間結(jié)構(gòu)，抑制成纖維細(xì)胞分化，下調(diào)皮膚組織抗氧化能力，增加氧化應(yīng)激，并可通過(guò)影響細(xì)胞賴(lài)以生存的微環(huán)境造成修復(fù)細(xì)胞遷移、增殖能力下降，細(xì)胞外基質(zhì)合成障礙，選擇性地誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡，破壞膠原纖維，造成遷移到創(chuàng)面的成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，最終表現(xiàn)為皮膚變薄、膠原纖維表達(dá)減少及創(chuàng)面愈合延緩［14］。AGE的聚集亦可使Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、硫酸軟骨素等細(xì)胞外基質(zhì)分子發(fā)生糖基化修飾，造成形態(tài)及功能異常，進(jìn)而影響皮膚電荷和空間屏障的完整性，加速糖尿病皮膚病變的發(fā)生發(fā)展［15］。

表2 不同病程糖尿病小鼠皮膚組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）和丙二醛含量（±s）

表2 不同病程糖尿病小鼠皮膚組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）和丙二醛含量（±s）

注：t值為同周齡對(duì)照組與糖尿病組相比

4周組別 只數(shù)丙二醛（μmol/L）對(duì)照組 10 26.39±3.74 1.00±0.10 4.82±0.56 29.91±6.50 1.18±0.18 5.15±0.46糖尿病組 10 37.47±10.65 1.89±0.33 6.62±0.47 47.70±5.66 3.01±0.36 8.63±0.36 t值 3.10 5.10 7.80 6.53 9.16 18.75 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 12周AGE（AUF/mg羥脯氨酸）AGE相對(duì)表達(dá)（n=4）丙二醛（μmol/L）AGE（AUF/mg羥脯氨酸）AGE相對(duì)表達(dá)（n=4）

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠皮膚組織膠原纖維性狀發(fā)生明顯改變，具體表現(xiàn)為膠原纖維總量減少，交聯(lián)程度降低，Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)下調(diào)，可能與皮膚組織中高AGE水平引起氧化損傷有關(guān)，提示抑制AGE的合成、阻斷AGE的作用環(huán)節(jié)或清除皮膚微環(huán)境中的AGE，有可能成為調(diào)控糖尿病皮膚膠原纖維性狀的新途徑和新手段。

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2014-01-17）

（本文編輯：尚淑賢）

Expressions of advanced glycosylation end products in skin of diabetic mice and their influence on collagen fibers

Yang Shengju*,Meng Guoliang,Gu Lixiong,Wang Jianli.*Department of Dermatology and Venereology,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,Jiangsu,China

；Wang Jianli,Email；pfkwang@163.com

ObjectiveTo investigate the expressions of advanced glycosylation end products（AGE）in skin of mice with diabetes mellitus（DM）for different durations,and to evaluate their influence on collagen fibers.MethodsForty healthy 8-week-old male C57BL/6J mice were divided into DM group （n=20）and control group（n=20）to receive multiple intraperitoneal injections of low dose streptozotocin （50 mg/kg）and citric acid buffer（0.1 mol/L）,respectively,for 5 consecutive days.Ten mice were sacrificed in each group on week 4 and 12 respectively after the last intraperitoneal injection,and full-thickness skin tissue samples were harvested from the middorsal region of each mouse.Then,hematoxylin-eosin （HE） staining was performed to observe histological changes,and total collagen content was estimated according to hydroxyproline content measured by an alkalinehydrolysis method.The cross-linking degree of collagen was determined by Edman degradation method using pepsin,the mRNA expression level of collagen type I andⅢby real-time quantitative PCR,the content of AGE by fluorospectrophotometry and Western blotting,and the level of malondialdehyde（MDA）by using a thiobarbituric acid method.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsAs light microscopy showed,the skin became obviously thinner in the diabetic mice with a progressive decrease in the number of collagen fibers in comparison with the control mice.On week 4 and 12 after the last injection,the diabetic mice exhibited a significant reduction in the content of hydroxyproline（（684.5 ± 76.7） vs.（787.7 ± 87.7） mg/g,（558.1 ± 73.1） vs.（757.8 ± 75.3） mg/g,bothP＜0.01）and in the levels of cross-linked collagen as well as mRNA expressions of collagen I and III（P＜0.01 or 0.05）,but a significant increase in the content of AGE （（37.47 ± 10.65） vs.（26.39 ± 3.74） AUF/mg hydroxyproline,（47.70±5.66）vs.（29.91±6.50）AUF/mg hydroxyproline,bothP＜0.01）and MDA （（6.62±0.47） vs.（4.82 ± 0.56） μmol/L,（8.63 ± 0.36） vs.（5.15 ± 0.46） μmol/L,bothP＜ 0.01） in skin tissue,compared with the control mice.The level of non-cross-linked collagen in skin tissue was also lower in the diabetic mice than in the control mice on week 12 （P＜0.05）.Moreover,the contents of hydroxyproline and the expression levels of collagen I in skin were significantly lower（P＜ 0.05）,but the levels of AGE and MDA were significantly higher（P ＜0.01）in the diabetic mice on week 12 than in those on week 4.ConclusionsThe characteristics of collagen fibers in skin are altered in diabetic mice when compared with normal control mice,which may be associated with increased AGE content and oxidative injury in skin.

Skin；Diabetes mellitus；Collagen typeⅠ；Collagen typeⅢ；Glycosylation end products,advanced

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.005

江蘇省高校自然科學(xué)基金（12KJB310012）；南通大學(xué)自然科學(xué)項(xiàng)目（11Z015）

226001江蘇，南通大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科（楊圣菊、顧黎雄、王建力）；南通大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系（孟國(guó)梁）

王建力，Email：pfkwang@163.com