柳小婧 徐峰 韓毓梅 盛友漁 繆盈 胡瑞銘 郭霞 齊思思 楊勤萍

斑禿患者外周血Th17細(xì)胞的檢測

柳小婧 徐峰 韓毓梅 盛友漁 繆盈 胡瑞銘 郭霞 齊思思 楊勤萍

目的分析Th17細(xì)胞與斑禿病程、病情等的關(guān)系。方法分別抽取斑禿組和健康對照組的外周血，流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞的比例，用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果斑禿組60例外周血中Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例（1.33%±0.74%）顯著高于30例健康對照組（0.91%±0.54%，P＜0.01）。初發(fā)斑禿患者Th17細(xì)胞比例顯著高于復(fù)發(fā)患者（P＜0.05），活動(dòng)期高于非活動(dòng)期（P＜0.05），病程≤6個(gè)月者高于病程＞6個(gè)月者（P＜0.01），而頭皮脫發(fā)面積≤50%者與脫發(fā)面積＞50%及全禿和普禿者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論外周血Th17細(xì)胞的水平與斑禿活動(dòng)性、疾病復(fù)發(fā)及病程有關(guān)。

斑禿；自身免疫；Th17細(xì)胞

Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌白細(xì)胞介素17（IL-17），對細(xì)胞外抗原發(fā)揮促炎癥作用，在器官特異性自身免疫性疾病中有獨(dú)特的作用，其在斑禿中的作用也逐漸受到重視［1］。本研究旨在探討Th17細(xì)胞在斑禿免疫發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、對象與方法

1.對象：2011年1月至2012年3月復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科脫發(fā)專病門診的斑禿患者60例為斑禿組，均符合Oslen斑禿指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠及哺乳期婦女；②有其他系統(tǒng)疾病、精神疾患等病史者；③有其他炎癥性、腫瘤性或自身免疫性等皮膚病；④1個(gè)月內(nèi)接受過任何口服藥物（糖皮質(zhì)激素類、復(fù)方甘草酸苷等）、注射或照射等治療；⑤1周內(nèi)外用過糖皮質(zhì)激素、米諾地爾等。斑禿組男25例，女35例，年齡（35.05±13.50）歲。健康體檢者30例為健康對照組，兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2.斑禿的分類與分期：根據(jù)Olsen等的分類標(biāo)準(zhǔn),按嚴(yán)重程度將斑禿分為輕型斑禿（頭皮脫發(fā)面積＜50%）和重型斑禿（脫發(fā)面積＞50%及全禿和普禿）［2］。活動(dòng)期斑禿定義為脫發(fā)區(qū)不斷擴(kuò)大或有新的脫發(fā)區(qū)出現(xiàn)，拔發(fā)試驗(yàn)陽性［3］。

3.方法：于早晨8～10時(shí)，分別抽取斑禿組和健康對照組肘靜脈血4 ml，F(xiàn)icoll法分離外周血單一核細(xì)胞（PBMC），調(diào)整細(xì)胞密度為4×106/ml，加入培養(yǎng)板，每孔加入佛波酯（PMA）50 μg/L+離子霉素 1 000 μg/L+布雷菲德菌素 A（BFA）10 mg/L（均為美國 Sigma公司產(chǎn)品），于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h。流式抗體抗人CD4-FITC、抗人IL-17-PE均產(chǎn)自美國eBioscience公司，破膜套裝產(chǎn)自美國Invitrogen公司，染色具體步驟參照說明書。FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測Th17細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例，以淋巴細(xì)胞群設(shè)門，激光室工作波長488 nm。每份樣品檢測2×104個(gè)細(xì)胞。測定結(jié)果采用CellQuest功能軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析。

4.統(tǒng)計(jì)方法：SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。各組檢測數(shù)據(jù)均以±s表示，統(tǒng)計(jì)方法采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

斑禿組外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為（1.33±0.74）%， 顯著高于健康對照組（0.91± 0.54）%（t=2.81，P ＜0.01）。與初發(fā)斑禿患者比較，復(fù)發(fā)患者Th17細(xì)胞的比例顯著升高（t=2.66，P＜0.05）?；顒?dòng)期患者Th17細(xì)胞比例顯著高于非活動(dòng)期（t=2.04，P＜0.05）。而Th17細(xì)胞的比例在輕、重型斑禿之間及有無家族史之間，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。斑禿病程≤6個(gè)月者Th17細(xì)胞的比例（1.55%±0.89%）顯著高于病程 ＞6個(gè)月者（1.10% ±0.45%，t=2.48，P＜0.05）與健康對照組（0.91% ±0.54%，t=3.44，P＜0.05），而病程 ＞6個(gè)月者與健康對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 60例斑禿患者Th17細(xì)胞比例與病情的關(guān)系

三、討論

斑禿雖為局限性毛發(fā)疾病，但影響人們的生活質(zhì)量，并可伴有其他自身免疫性疾?。?］。斑禿的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制尚不明確。Lew等［5］研究韓國人群IL-17/IL-17RA多態(tài)性和易感性與斑禿的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，斑禿患者IL-17RA的單核苷酸多態(tài)性與健康對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Giordano等［6］發(fā)現(xiàn)斑禿患者IL-17A和腫瘤壞死因子α水平較對照組升高。Tanemura等［7］觀察4例斑禿患者皮損發(fā)現(xiàn)，真皮內(nèi)、尤其是毛囊周圍有CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞浸潤。我們的研究發(fā)現(xiàn)，斑禿患者外周血Th17細(xì)胞比例較健康對照顯著升高，病程≤6個(gè)月患者Th17細(xì)胞水平顯著高于病程＞6個(gè)月患者，活動(dòng)期高于非活動(dòng)期，與王博、楊淑霞等［1］發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期斑禿患者IL-17升高的結(jié)果一致。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)，斑禿復(fù)發(fā)患者Th17細(xì)胞比例高于初發(fā)患者，提示復(fù)發(fā)患者的自身免疫狀態(tài)更加值得注意。

[1]王博,楊淑霞.斑禿患者血清中部分細(xì)胞因子研究[J].臨床皮膚科雜志,2011,40（6）；332-334.

[2]Olsen E,Hordinsky M,McDonald-Hull S,et al.Alopecia areata investigational assessment guidelines.National Alopecia Areata Foundation[J].J Am Acad Dermatol,1999,40（2 Pt 1）；242-246.

[3]趙辨.中國臨床皮膚病學(xué)[M].3版.南京；江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2010；1186-1187.

[4]慕彰磊,徐峰,楊勤萍.斑禿患者757例的臨床資料分析[J].上海醫(yī)學(xué),2010,33（7）；653-655.

[5]Lew BL,Cho HR,Haw S,et al.Association between IL17A/IL17RA gene polymorphisms and susceptibility to alopecia areata in the Korean population[J].Ann Dermatol,24（1）；61-65.

[6]Giordano CN,Sinha AA.Cytokine pathways and interactions in alopecia areata[J].Eur J Dermatol,2013,23（3）；308-318.

[7]Tanemura A,Oiso N,Nakano M,et al.Alopecia areata；infiltration of Th17 cells in the dermis,particularly around hair follicles[J].Dermatology,2013,226（4）；333-336.

2014-01-01）

（本文編輯：吳曉初）

Detection of T helper type 17 cells in peripheral blood of patients with alopecia areata

Liu Xiaojing,Xu Feng,Han Yumei,Sheng Youyu,Miao Ying,Hu Ruiming,Guo Xia,Qi Sisi,Yang Qinping.Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

；Yang Qinping,Email；dxq93216@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the relationship of peripheral blood T helper type 17（Th17）cells with the clinical course and severity of alopecia areata（AA）.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 60 patients with AA and 30 healthy human controls.Flow cytometry was performed to determine the proportion of Th17 subsets in these samples.Statistical analysis was done by two independent samplest-test with SPSS software version 16.0.ResultsThe proportion of Th17 subsets in peripheral blood CD4+T cells was significantly higher in the AA patients than in the healthy controls（1.33% ±0.74%vs.0.91% ±0.54%,P＜0.01）,higher in patients with initial AA than in those with recurrent AA（P＜ 0.05）,higher in patients with active AA than in those with inactive AA（P＜ 0.05）,higher in patients with a clinical course of＜ or=6 months than in those＞ 6 months （P＜ 0.01）.No significant difference was observed in the proportion of peripheral blood Th17 cells between patients with AA involving no more than 50%of the scalp and those with AA involving more than 50%of the scalp,alopecia totalis or alopecia universalis （P ＞ 0.05）.ConclusionThe level of peripheral blood Th17 cells is associated with the activity,relapse,and clinical course of AA.

Alopecia areata；Autoimmunity；Th17 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.012

2012年度中華醫(yī)學(xué)會皮膚性病學(xué)分會美能皮膚病學(xué)研究基金

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科

楊勤萍，Email：dxq93216@medmail.com.cn