侯巍 許慶芳 劉晨 鄭躍 賴維

組織蛋白酶B 在急性光損傷皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及意義

侯巍 許慶芳 劉晨 鄭躍 賴維

目的探討組織蛋白酶B（CatB）在急性光損傷人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）中的表達(dá)變化及意義。方法體外培養(yǎng)原代HDF，選取第4～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射組和不照射的對(duì)照組。CCK8法分別檢測(cè)5、10、15、20和25 J/cm2UVA照射后HDF的增殖率。用10 J/cm2UVA單次照射致HDF急性光損傷，Western印跡及實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR分別檢測(cè)急性光損傷組HDF及對(duì)照組HDF照射后24、48、72 h CatB 蛋白及 mRNA 表達(dá)；另外分別用 10、15、20、25 J/cm2UVA 照射 HDF，Western印跡及實(shí)時(shí)定量RT-PCR分別檢測(cè)急性光損傷組及對(duì)照組HDF照射后48 h CatB蛋白及基因表達(dá)。數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差分析，兩組間比較采用最小顯著差異法（LSD）。結(jié)果UVA照射導(dǎo)致HDF增殖率下降；當(dāng)UVA劑量≤10 J/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率均保持在85%以上，各照光組分別與對(duì)照組24、48、72 h時(shí)比較，均P＜0.05。Western印跡結(jié)果顯示，急性光損傷組（10 J/cm2UVA照射）CatB蛋白灰度值在照射后24 h（0.76±0.14）、48 h（1.34±0.38）、72 h（0.82±0.09）均較對(duì)照組（分別為0.35±0.01、0.45±0.12、0.61±0.06）升高（均P＜0.05）。實(shí)時(shí)定量RT-PCR顯示，在急性光損傷組CatB的mRNA表達(dá)在照射后24 h（0.149±0.009）、48 h（0.173±0.009）、72 h（0.185±0.158） 也較對(duì)照組（分別為0.089±0.015、0.091±0.010、0.111±0.017） 上調(diào)（均P＜0.05）。10、15、20、25 J/cm2UVA 照射HDF后 48 h，CatB的蛋白灰度值分別為 0.99 ± 0.07、1.49± 0.14、1.89 ±0.08、2.07±0.06，均較對(duì)照組（0.60±0.05）升高（均P＜0.05），CatB的mRNA表達(dá)也較對(duì)照組升高。結(jié)論UVA致急性光損傷的皮膚成纖維細(xì)胞中CatB蛋白及mRNA表達(dá)均上調(diào)。

成纖維細(xì)胞；紫外線；輻射損傷，實(shí)驗(yàn)性；組織蛋白酶B

組織蛋白酶B（CatB）參與細(xì)胞遷移、增殖及凋亡等的調(diào)節(jié)，同時(shí)在細(xì)胞外基質(zhì)重塑中也起到重要作用，參與皮膚損傷修復(fù)及瘢痕形成［1］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，除基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）外，組織蛋白酶等其他的酶也參與皮膚光老化發(fā)生。在光老化的皮膚及細(xì)胞模型中，CatB的表達(dá)均已被證實(shí)發(fā)生改變［2］。但在急性光損傷中CatB的變化還鮮見報(bào)道。為進(jìn)一步探索CatB在光損傷中的作用，我們研究長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射導(dǎo)致皮膚成纖維細(xì)胞急性光損傷后CatB的表達(dá)變化，觀察該變化在時(shí)間上的規(guī)律及與UVA劑量之間的關(guān)系。

材料與方法

一、材料

1.皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)標(biāo)本：來(lái)自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科門診健康兒童包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.主要試劑及儀器：DMEM（Dulbecco′s modified Eagle′s media）高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、胰酶、青鏈霉素產(chǎn)自美國(guó)Gibco公司；CCK8試劑產(chǎn)自日本Dojindo公司；Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司。光源使用UVA輻射儀（美國(guó)Sigma公司，ss-03A）， 燈管為 Philips UVA TLl0RS，波長(zhǎng)320～400 nm。UVA照射計(jì)產(chǎn)自上海希格瑪高科技有限公司。一抗兔抗人組織蛋白酶B多克隆IgG抗體、內(nèi)參兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆IgG抗體、二抗辣根過(guò)氧化物酶（HRP）-羊抗兔 IgG產(chǎn)自美國(guó) Cell Signaling Technology公司。全蛋白提取試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒產(chǎn)自中國(guó)凱基公司；ECL顯色試劑盒產(chǎn)自美國(guó)Millipore公司；預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（marker）產(chǎn)自加拿大MBI Fermentas公司；Trizol產(chǎn)自美國(guó)Invitrogen公司；第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒、CatB引物、GAPDH引物產(chǎn)自日本TaKaRa公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek公司），熒光倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；ABI PRISM 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

二、方法

1.皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)及UVA照射：取3～9歲小兒包皮，參照文獻(xiàn)［3］方法常規(guī)分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。原代細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，按1∶2傳代，3～4代細(xì)胞凍存。細(xì)胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)皿，分為UVA照射組和不照射的對(duì)照組。當(dāng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%～90%融合時(shí)（即6×105個(gè)細(xì)胞/ml），照射組予以UVA單次照射，照射劑量分別為 5、10、15、20 和 25 J/cm2。照射時(shí)燈管距離培養(yǎng)皿的垂直距離為21 cm，相應(yīng)空白對(duì)照組予以與照光時(shí)長(zhǎng)相等的避光。照射完成后，加入新鮮培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于95%濕度、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至UVA照射后24、48和72 h，分別進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞增殖活力檢測(cè)：各組細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，檢測(cè)時(shí)每孔加入10 μl CCK8試劑，37℃孵育3 h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定450 nm的吸光度A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.Western印跡檢測(cè)CatB蛋白表達(dá)：各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后，按試劑盒操作提取細(xì)胞總蛋白，保存于-70℃冰箱，BCA法蛋白定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印到PVDF膜，5%封閉液孵育 1 h。一抗兔抗人 CatB-IgG（濃度 1∶1 000），內(nèi)參兔抗人 GAPDH-IgG（濃度 1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。吐溫三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBST）洗膜，二抗辣根過(guò)氧化物酶（HRP）-羊抗兔 IgG（濃度 1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜。將膜置于暗盒中，ECL顯色試劑盒A液及B液1∶1混合后孵育2～3 min，曝光，顯影，定影。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Western印跡結(jié)果采用凝膠圖像處理系統(tǒng)ImageJ軟件分析CatB條帶的密度。

4.RT-PCR檢測(cè)CatB mRNA表達(dá)水平：各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后，用Trizol試劑提取RNA，焦碳酸二乙酯（DEPC）水作空白對(duì)照，測(cè)定RNA濃度及純度（A260/A280）。用第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系總體積20 μl，37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃5 s，得到cDNA，-20℃冰箱保存。相對(duì)定量分析采用染料法。PCR反應(yīng)體系為20 μl，包括上游和下游引物各 0.8 μl，cDNA 2 μl，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl，ROXDyeⅡ 0.4 μl，雙蒸水6 μl。標(biāo)準(zhǔn)程序兩步法PCR擴(kuò)增：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。組織蛋白酶B上游引物：5′-CTGACCGGATCTGCATCCAC-3′，下游引物：5′-GAAGTTCCAAGCTTCAGCAGGATAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度131 bp；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度138 bp。使用ABI PRISM 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀反應(yīng)，結(jié)束后讀取擴(kuò)增曲線、熔解曲線和Ct值，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)水平。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行分析。結(jié)果行方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析（ANOVA），兩組間比較采用最小顯著差異（LSD）法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同劑量UVA照射后細(xì)胞增殖活性

UVA照射后24、48和72 h，0～25 J/cm2UVA呈劑量依賴性抑制HDF增殖。見表1。UVA劑量≤10 J/cm2照射后24、48、72 h，細(xì)胞存活率均保持在85%以上；而UVA劑量≥15 J/cm2時(shí)細(xì)胞存活率明顯下降，≥ 20 J/cm2時(shí)為50%左右，至25 J/cm2時(shí)僅約25%，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10 J/cm2UVA照射HDF造成的急性光損傷。

表1 長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射后24、48、72 h人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖活性（A450，±s）

表1 長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射后24、48、72 h人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖活性（A450，±s）

注：n=3

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 1.00 1.00 1.00 5 J/cm2UVA照射組 0.98±0.01 0.97±0.02 0.97±0.02 10 J/cm2UVA照射組 0.92±0.02 0.91±0.01 0.91±0.01 15 J/cm2UVA照射組 0.82±0.02 0.76±0.01 0.76±0.02 20 J/cm2UVA照射組 0.64±0.05 0.58±0.03 0.58±0.03 25 J/cm2UVA照射組 0.31±0.03 0.20±0.01 0.20±0.02 F值 267.00 949.00 500.00 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

二、UVA照射后不同時(shí)間CatB mRNA及蛋白表達(dá)

10 J/cm2UVA 照射 HDF 后 24、48、72 h，CatB mRNA的表達(dá)照射組較相應(yīng)對(duì)照組均升高，其中72 h升高最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。CatB蛋白表達(dá)均較相應(yīng)對(duì)照組上調(diào)，并在48 h達(dá)峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

三、不同劑量UVA照射HDF后48 h CatB mRNA及蛋白表達(dá)

圖1 10 J/cm2UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞后不同時(shí)間組織蛋白酶B（CatB） 蛋白的表達(dá) 1、3、5：分別為對(duì)照組24 h、48 h、72 h時(shí)； 2、4、6：分別為照射組 24、48、72 h 時(shí)。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖2 長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細(xì)胞后48 h組織蛋白酶 B（CatB）蛋白的表達(dá) 1： 對(duì)照組； 2 ～ 5：10、15、20、25 J/cm2 UVA照射組。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表3 長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細(xì)胞后48 h組織蛋白酶B（CatB）mRNA及蛋白表達(dá)（±s）

表3 長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細(xì)胞后48 h組織蛋白酶B（CatB）mRNA及蛋白表達(dá)（±s）

注：n=3

組別 CatB mRNA CatB蛋白對(duì)照組 1.00±0.00 0.60±0.05 10 J/cm2UVA照射組 1.16±0.05 0.99±0.07 15 J/cm2UVA照射組 1.27±0.06 1.49±0.14 20 J/cm2UVA照射組 1.46±0.04 1.89±0.08 25 J/cm2UVA照射組 1.70±0.02 2.07±0.06 F值 95.15 149.29 P值 ＜0.05 ＜0.05

表2 10 J/cm2長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細(xì)胞后不同時(shí)間組織蛋白酶B（CatB）mRNA及蛋白表達(dá)（±s）

表2 10 J/cm2長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細(xì)胞后不同時(shí)間組織蛋白酶B（CatB）mRNA及蛋白表達(dá)（±s）

注：n=3

組別 mRNA蛋白24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 0.089±0.015 0.091±0.010 0.111±0.017 0.35±0.01 0.45±0.12 0.61±0.06 UVA組 0.149±0.009 0.173±0.009 0.185±0.158 0.76±0.14 1.34±0.38 0.82±0.09 t值 5.63 10.9 5.57 3.99 3.89 3.36 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

10、15、20、25 J/cm2UVA 照射 HDF 后 48 h，CatB mRNA表達(dá)呈劑量依賴性上升，各UVA照射組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。CatB蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高，并呈劑量依賴性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖2。

討 論

CatB屬于半胱氨酸組織蛋白酶，作用底物廣泛，可降解Ⅳ型膠原、纖維蛋白原、纖連蛋白、層黏連蛋白、蛋白聚糖等多種基質(zhì)成分［4］。近年組織蛋白酶在光損傷中的作用也受到關(guān)注［5-6］。

Lai等［7］研究發(fā)現(xiàn)，CatB在正常皮膚組織有表達(dá)，在誘導(dǎo)光老化的皮膚組織及成纖維細(xì)胞中表達(dá)下降，推測(cè)CatB表達(dá)減少可能通過(guò)減弱皮膚修復(fù)功能、導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)平衡失調(diào)參與光老化發(fā)生。Lamore等［8］對(duì)UVA照射慢性光損傷后成纖維細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)最明顯的也是CatB。還發(fā)現(xiàn)慢性UVA照射可導(dǎo)致CatB成熟過(guò)程改變并特異性使酶喪失活性，但該研究未見CatB基因表達(dá)的數(shù)據(jù)。Bivik等［9］用60 J/cm2UVA和500 mJ/cm2UVB誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞急性光損傷，在黑素細(xì)胞凋亡過(guò)程中觀察到CatB定位發(fā)生改變，從溶酶體轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，但是對(duì)于CatB的表達(dá)變化未見研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，UVA單次照射HDF致急性光損傷后，CatB蛋白和mRNA表達(dá)在照射后24、48、72 h均增加，并且CatB蛋白升高以48 h最明顯；同時(shí)用不同劑量UVA照射后發(fā)現(xiàn)，CatB蛋白和mRNA的表達(dá)隨UVA劑量增加表達(dá)上調(diào)也增加。

UVA照射后慢性光損傷和急性光損傷細(xì)胞模型中CatB表達(dá)改變呈相反趨勢(shì)。這種急、慢性光損傷中的不同變化趨勢(shì)，可能預(yù)示CatB在兩種光損傷過(guò)程中的作用存在不同。在老化細(xì)胞中脂褐素堆積是重要的表現(xiàn)［10-11］，所謂脂褐素是指細(xì)胞內(nèi)形成和積聚的高度氧化和交聯(lián)的蛋白質(zhì)，絕大多數(shù)的脂褐素局限于溶酶體內(nèi)，老化的細(xì)胞較年輕的細(xì)胞含有更多的脂褐素。從降解受損的自身蛋白的作用考慮，光老化成纖維細(xì)胞中下降的CatB可能使溶酶體清除受損的細(xì)胞蛋白的能力下降，從而造成細(xì)胞內(nèi)脂褐素堆積，光老化發(fā)生。而在急性光損傷中，UVA可能通過(guò)提高轉(zhuǎn)錄、增加CatB釋放等途徑提高CatB表達(dá)水平，上調(diào)的CatB則通過(guò)其具有的膠原降解、蛋白水解能力參與光損傷的發(fā)生。CatB還可清除金屬蛋白酶組織抑制劑-1、2［12］，當(dāng) CatB 表達(dá)上調(diào)時(shí)，其清除作用也增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致MMP激活，加劇光損傷。還有研究表明，CatB可導(dǎo)致尿激酶纖溶酶原激活物和組織型纖溶酶原激活物釋放，激活纖溶酶，促發(fā)蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)［13］，從而進(jìn)一步促發(fā)光損傷。

有研究［14］顯示，在慢性光損傷的皮膚成纖維細(xì)胞中CatB酶的活性受到明顯抑制。CatB功能的多樣性使得其在光損傷中可能起到多重作用，在急、慢性光損傷中發(fā)揮不同的功效。

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2013-12-13）

（本文編輯：尚淑賢）

Expression of cathepsin B in acute ly photodamaged fibroblasts and its significance

Hou Wei*,Xu Qingfang,Liu Chen,Zheng Yue,Lai Wei.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China

；Lai Wei,Email；drlaiwei@163.com

ObjectiveTo investigate the changes in cathepsin B （CatB） expression in acutely photodamaged human dermal fibroblasts （HDFs） and their significance.MethodsHDFs were isolated from the foreskin of children,and subjected to primary culture and subculture.The fourth-to eighth-passage HDFs were used in the following experiment.HDFs were divided into two groups to receive irradiation with different doses of ultraviolet A（UVA） for different durations（acutely photodamaged group） or remain unirradiated（control group）.Cell counting kit-8 （CCK8）assay was conducted to evaluate the proliferative activity of HDFs after irradiation with UVA at 5,10,15,20 and 25 J/cm2respectively.Western blot and quantitative real-time reverse transcription PCR were performed to measure the protein and mRNA expressions of CatB respectively in HDFs at 24,48 and 72 hours after exposure to UVA at 10 J/cm2,and at 48 hours after exposure to UVA at 10,15,20 and 25 J/cm2.Statistical analysis was carried out by analysis of variance and least significant difference（LSD）test using the SPSS 13.0 software.ResultsUVA radiation induced a decrease in the proliferative activity of HDFs.When the dose of UVA was≤10 J/cm2,the survival rate of HDFs maintained higher than 85%,and significant differences were observed in cell survival rate between unirradiated and irradiated HDFs at 24,48 and 72 hours （allP＜ 0.05）.Western blot showed that the gray value of CatB protein in the acutely photodamaged group irradiated with 10 J/cm2UVA was significantly higher than that in the control group at 24 hours（0.76±0.14 vs.0.35±0.01,P＜0.05）,48 hours（1.34±0.38 vs.0.45±0.12,P＜0.05）and 72 hours（0.82±0.09 vs.0.61±0.06,P＜0.05）.Increased mRNA expressions of CatB were also observed in the acutely photodamaged group compared with the control group at 24 hours（0.149±0.009 vs.0.089±0.015,P＜0.05）,48 hous（0.173±0.009 vs.0.091±0.010,P＜0.05）and 72 hours（0.185 ± 0.158 vs.0.111 ± 0.017,P＜ 0.05）after UVA radiation at 10 J/cm2.The gray value of CatB protein was 0.99±0.07,1.49±0.14,1.89±0.08,2.07±0.06 in HDFs at 48 hours after exposure to UVA of 10,15,20 and 25 J/cm2,respectively,significantly higher than that in the control group（0.60 ± 0.05,allP ＜ 0.05）.Similarly,the mRNA expression of CatB was up-regulated in HDFs at 48 hours after UVA radiation at 10,15,20 and 25 J/cm2compared with the unirradiated HDFs.ConclusionThe protein and mRNA expressions of CatB are up-regulated in acutely photodamaged HDFs induced by UVA radiation.

Fibroblasts；Ultraviolet rays；Radiation injuries,experimental；Cathepsin B

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171523）；廣東省自然科學(xué)基金（10151008901000117）

830054烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科（侯巍）；中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚性病科（許慶芳、劉晨、鄭躍、賴維）

賴維，Email：drlaiwei@163.com