胡陽(yáng) ,孫越 ,李婷 ,陳向明 ,張海清 ,俞愛(ài)華 ,王國(guó)江
(1.上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院,上海201802;2.上海市交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院,上海200080)
中醫(yī)文獻(xiàn)中“發(fā)物”多指辛辣、海鮮、葷腥厚味食物[1],此類食物可能是導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)性皮膚病加重、反復(fù)難愈的因素之一[2]。中醫(yī)將容易激發(fā)宿疾復(fù)發(fā)或加重現(xiàn)有疾病的食物稱為“發(fā)物”,且十分重視對(duì)“發(fā)物”的忌口。但由于缺乏客觀指標(biāo),“發(fā)物”忌口的科學(xué)性常受到質(zhì)疑。變應(yīng)性接觸性皮炎(Allergic contact dermatitis,ACD)是接觸性變應(yīng)原引起的一種Ⅳ型變態(tài)反應(yīng),是臨床常見(jiàn)的炎癥性皮膚病。本研究利用2,4-二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo) BALB/c小鼠ACD模型,觀察羊肉、帶魚(yú)、青椒、香菇、竹筍5種傳統(tǒng)“發(fā)物”對(duì)其皮膚損害及相關(guān)細(xì)胞因子的影響,并探討可能的作用機(jī)制,從而對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)“發(fā)物”理論進(jìn)行實(shí)驗(yàn)論證,為臨床指導(dǎo)患者合理的飲食提供客觀依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~8周齡SPF級(jí)雌性BALB/C小鼠,體質(zhì)量18~22 g(上海斯萊克動(dòng)物中心提供)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):scxk(滬)2008-0016。在一定的溫度和濕度環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DNFB(上?;瘜W(xué)試劑公司),丙酮(上海試劑廠)。小鼠γ-干擾素(IFN-γ),白細(xì)胞介素(IL-17)ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司,上??婆d生物公司代購(gòu),批號(hào)20121102)。
1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電子分析天平(精確度0.1 mg,上海精密科學(xué)儀器有限公司FA1004),皮膚圓形打孔器(直徑 8 mm),光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS B×43F)及成像系統(tǒng)(micropublisher3.3RTV,QIMAGING ROHS,CANADA)。BIO-TEK 酶標(biāo)儀(型號(hào) ELX-800)。
1.4 實(shí)驗(yàn)分組及方法 78只小鼠隨機(jī)分成羊肉組、帶魚(yú)組、香菇組、青椒組、竹筍組、對(duì)照組、正常組,前6組每組12只小鼠,參照文獻(xiàn)[3]制作經(jīng)典ACD小鼠模型。實(shí)驗(yàn)前1 d,腹部剃毛,面積約3 cm2,實(shí)驗(yàn)1 d和2 d分別在去毛部位涂0.5%DNFB(溶劑為丙酮∶橄欖油=4∶1的混合液)20 μL各致敏 1次,實(shí)驗(yàn)6 d在小鼠右耳內(nèi)外側(cè)涂0.2%DNFB 10 μL,激發(fā)ACD。左耳涂等量丙酮橄欖油基質(zhì)作對(duì)照。正常組6只小鼠為健康小鼠。羊肉、竹筍、帶魚(yú)、青椒、香菇各500 g,煎煮濃縮至2 g/mL,分別對(duì)相應(yīng)組別小鼠進(jìn)行灌胃,首次灌胃于激發(fā)前1 d,1次/d,每次量以0.02 mL/g計(jì)算。對(duì)照組用等量純水灌胃。
1.5 觀察指標(biāo)及方法
1.5.1 耳厚度 分別于激發(fā)后24,48 h處死小鼠,用直徑8 mm的打孔器,分別鉆取左右耳中部的組織,將鉆下耳組織制成HE染色切片。參照文獻(xiàn)[4]在光學(xué)成像顯微鏡100倍鏡下,采用Q-capture pro7圖像處理軟件,測(cè)量組織切片中距耳緣端4 mm處的耳雙面距離,垂直于軟骨進(jìn)行測(cè)量,每只耳測(cè)量5次,取平均值,計(jì)算激發(fā)后小鼠左、右耳厚度差。
1.5.2 真皮單一核及多形核細(xì)胞總數(shù) 將鉆取的右耳組織制成HE染色切片,每張HE切片在光鏡顯微鏡400倍鏡下,取5個(gè)不重疊視野,進(jìn)行炎癥細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù),取平均值。
1.5.3 外周血IFN-γ、IL-17檢測(cè) 分別于激發(fā)后24,48 h摘眼球取血1 mL,離心后分離血清,低溫冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測(cè)小鼠外周血IFN-γ、IL-17水平,檢測(cè)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,將反應(yīng)板放入酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔IFN-γ、IL-17的濃度值(單位為 mg/L)。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用graphpad prism 5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示,“發(fā)物”各組與對(duì)照組及正常組間均數(shù)比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 耳厚度 激發(fā)后24 h,“發(fā)物”各組耳腫脹與對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);激發(fā)后48 h,羊肉、青椒組耳腫脹較對(duì)照組顯著增高(P<0.05),帶魚(yú)、竹筍、香菇組與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表 1。
2.2 炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 與對(duì)照組比較,激發(fā)后24 h羊肉組耳組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多(P<0.05),激發(fā)后48 h,羊肉、青椒組炎癥細(xì)胞均顯著增多(P<0.05),帶魚(yú)、竹筍、香菇組24 h及48 h與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1
表1 激發(fā)后24,48 h耳腫脹及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) (±s)
表1 激發(fā)后24,48 h耳腫脹及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) (±s)
注:*與對(duì)照組相比P<0.05。
組別 n 耳腫脹(μm) 炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)24 h 48 h 24 h 48 h對(duì)照組 6 179.03±26.84 177.73±24.64 112.89±24.59 119.24±18.04羊肉組 6 220.61±36.99 278.58±45.48*143.65±31.06*189.38±42.68*帶魚(yú)組 6 204.18±38.22 212.38±34.25 119.91±20.55 126.34±23.46香菇組 6 200.68±29.33 204.19±29.61 128.81±20.91 123.63±10.94青椒組 6 207.87±14.58 271.99±64.68*135.31±11.02 196.22±56.64*竹筍組 6 175.38±25.67 172.32±25.09 113.38±25.67 115.24±65.02 F值 2.45 11.54 3.84 28.63 P 值 >0.05 <0.05 <0.05 <0.05
2.3 外周血IFN-γ、IL-17水平變化 與正常組相比,誘導(dǎo)小鼠ACD后,各組IFN-γ、IL-17均明顯升高(P<0.05)。與對(duì)照組相比,竹筍組 IFN-γ、IL-17 水平明顯降低(P<0.05),帶魚(yú)、香菇組兩種細(xì)胞因子差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),羊肉、青椒組 24 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),48 h IFN-γ、IL-17 水平顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表 2。
表2 激發(fā)后24,48 h小鼠血清IFN-γ、IL-17水平變化
長(zhǎng)期以來(lái),皮膚病患者的飲食忌口很多,但大多是根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn),或不明飲食禁忌,導(dǎo)致疾病加重,或盲目忌口造成營(yíng)養(yǎng)失衡,免疫力下降,影響疾病的恢復(fù)。羊肉、帶魚(yú)、青椒、香菇、竹筍是常用食物,也是中醫(yī)傳統(tǒng)認(rèn)為的“發(fā)物”。研究表明花生四烯酸、前列腺素等重要變應(yīng)性活性介質(zhì)是由n-6族脂肪酸轉(zhuǎn)變而來(lái),n-3不飽和脂肪酸在特應(yīng)性發(fā)病中是一個(gè)有利的因素[5]。羊肉中含有花生四烯酸,海鮮中含有n-3不飽和脂肪酸。青椒中辣椒素可導(dǎo)致血管擴(kuò)張等神經(jīng)源性炎癥效應(yīng)。香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用。竹筍具有低脂肪、低糖、高纖維素等特點(diǎn)。本研究觀察其對(duì)小鼠ACD模型的影響,并探討可能的作用機(jī)制。DNFB腹部誘導(dǎo),耳廓激發(fā)小鼠模型是目前最為常用的ACD動(dòng)物模型,該模型可用于評(píng)估食品及其中成分對(duì)過(guò)敏性疾病的干預(yù)研究[6]。ACD是一種以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及組織變性壞死為主要病理特征的炎性反應(yīng)。耳厚度及單位面積單一核及多形核細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量變化是反應(yīng)ACD嚴(yán)重程度的常用指標(biāo)。從研究結(jié)果來(lái)看羊肉、青椒能明顯加重小鼠耳廓炎癥腫脹,增加局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),48 h時(shí)尤為顯著,表現(xiàn)出有加重小鼠ACD作用。帶魚(yú)、竹筍、香菇組對(duì)小鼠ACD炎癥程度無(wú)明顯影響。
ACD是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng),研究證明Th1和Th17細(xì)胞在ACD的發(fā)病過(guò)程中均起重要作用。其各自分泌的IFN-γ和IL-17均為ACD效應(yīng)階段重要的細(xì)胞因子。IFN-γ是最有效的巨噬細(xì)胞激活因子,能活化多種細(xì)胞,調(diào)節(jié)多種免疫活性介質(zhì)的合成和分泌,加重炎癥反應(yīng)。He等[7]研究發(fā)現(xiàn) IFN-γ通過(guò)刺激和調(diào)節(jié) ROS(Reactive oxygen species,ROS)的活性而影響ACD反應(yīng)。IL-17能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性因子(如IL-6、IL-8等),調(diào)節(jié)趨化因子 CXCL1及黏附分子ICAM-1表達(dá),促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化和向炎癥部位募集,加重局部炎癥反應(yīng)[7-8]。通過(guò)檢測(cè)外周血細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn),激發(fā)ACD后各組IFN-γ、IL-17水平較正常小鼠均有不同程度的升高,并與ACD嚴(yán)重程度平行。與對(duì)照組相比,羊肉、青椒組48 h時(shí)IFN-γ、IL-17的釋放明顯增加,其加重小鼠ACD的作用可能與此有關(guān)。竹筍組2種細(xì)胞因子表達(dá)明顯下降,但其對(duì)小鼠ACD炎癥無(wú)抑制作用,是否與喂食時(shí)間及樣本量有關(guān),有待進(jìn)一步研究。帶魚(yú)、香菇對(duì)兩種細(xì)胞因子均無(wú)明顯影響。
變態(tài)反應(yīng)性皮膚病中醫(yī)辨證多與血熱,風(fēng)熱、濕毒有關(guān),本研究結(jié)果顯示,對(duì)此類疾病,羊肉、青椒溫?zé)嵝允澄?,與中醫(yī)“發(fā)物”吻合。
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