李 光 李 昶 侯 剛 康 健△

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是臨床上常見的睡眠障礙性疾病，有證據(jù)表明OSA與胰島素抵抗（IR）和（或）2型糖尿病有關(guān)，且獨(dú)立于肥胖的程度[1]，亦有證據(jù)表明OSA可以通過多種生物機(jī)制導(dǎo)致IR和2型糖尿病，而氧化應(yīng)激是其中最重的一種[2-3]。既然氧化應(yīng)激被認(rèn)為是OSA的病理生理機(jī)制之一，那么應(yīng)用抗氧化劑應(yīng)該可能對OSA患者有保護(hù)作用。為此，本研究選用間歇低氧（intermittent hypoxia，IH）動物模型來模擬OSA，探討聯(lián)合應(yīng)用抗氧化劑氮氧化物4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶（4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-ox?yl，TEMPOL）和還原型谷胱甘肽（reduced glutathi?one，GSH）對IH時氧化應(yīng)激誘導(dǎo)胰腺損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物與分組。50只體質(zhì)量為（22±2）g，8～12周的雄性健康清潔級C57BL/6J小鼠，購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為正常對照（CON）組、IH組、TEMPOL處理的IH（IH+TEMPOL）組、GSH處理的IH（IH+GSH）組，TEMPOL和GSH聯(lián)合處理的IH（IH+TEMPOL+GSH）組，每組各10只。（2）主要試劑與儀器。IH造模設(shè)備（Oxycycler Model A84XO，BioSpherix Instruments,Red?field,NY,USA），氧氣和氮?dú)猓ㄉ蜿柹驑?biāo)氣體有限公司），血糖儀（OneTouch Ultra，LifeScan），諾和靈R（諾和諾德公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法測定試劑盒（武漢博士德生物工程公司），TEMPOL,GSH（Sigma,St Louis，MO，USA）等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及給藥方法 各組小鼠均正常飲食水，保持12 h燈光12 h黑暗。CON組置于常壓培養(yǎng)箱中，空氣條件下飼養(yǎng)2周；IH組小鼠置于IH造模設(shè)備中，使氧氣濃度變化于21%～5%，持續(xù)4 min，而后氧氣濃度逐漸恢復(fù)至21%，持續(xù)4 min，每天持續(xù)8 h（8:00—16:00），共 2周?？寡趸瘎㏕EMPOL溶于飲食中（濃度為1 mmol/L），GSH（10 mg/100 g體質(zhì)量）每天于IH前30 min各腹腔注射1次。以上各組動物均于造模2周后實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 IR實(shí)驗(yàn) 各組小鼠于實(shí)驗(yàn)的最后8 h空腹，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即按0.75 U/kg劑量腹腔注射短效胰島素（諾和靈R），于注射前（0 min）和注射后15、30、60、90 min時剪尾尖采血，以血糖儀測定血糖水平。以0 min時血糖水平作為參比基礎(chǔ)，測定每一時間點(diǎn)的血糖比值。

1.2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 采用硫代巴比妥酸（TAB）法測定胰腺組織MDA的水平，黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活性，并采用比色法測定胰腺組織谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GR）的水平[4]。

1.2.4 TUNEL染色檢測胰腺β細(xì)胞凋亡率 胰腺切片經(jīng)20 mg/L蛋白酶K預(yù)處理15 min，用正常驢血清和BAS溶液阻滯，平衡后，于37℃時將TdT酶加入切片中1 h，加入終止溶液3,3＇,5,5＇-四甲基聯(lián)苯胺后，使用10 mmol/L PBS溶液沖洗切片，在室溫下滴加抗地高辛配基軛合物0.5 h。切片采用TUNEL+胰島素雙重染色：TUNEL染色β細(xì)胞核（綠色），胰島素染色細(xì)胞漿（紅色）。一個胰島TUNEL染色陽性β細(xì)胞的平均數(shù)（計(jì)數(shù)每組10只小鼠的20個胰腺切片上所有胰島TUNEL染色陽性β細(xì)胞數(shù)后，再除以胰島總數(shù)）×1 000后，比較5組小鼠胰腺β細(xì)胞凋亡率。凋亡率=單個TUNEL染色陽性β細(xì)胞數(shù)/單個胰島β細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間多重比較采用LSD-t法，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠IR試驗(yàn)的比較 30、60和90 min時，IH組在各時間點(diǎn)上血糖水平高于CON組（Plt;0.01），IH+TEMPOL+GSH組在上述相應(yīng)時點(diǎn)血糖水平低于IH組、IH+TEMPOL組和IH+GSH組（Plt;0.01），而IH組、IH+TEMPOL組和IH+GSH組血糖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表1。

Table 1 Comparison of the insulin resistance test at different time points between five groups表1 各組小鼠不同時點(diǎn)IR試驗(yàn)的比較（n=10，%，x±s）

2.2 各組小鼠胰腺氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 IH組胰腺組織中MDA水平高于CON組，SOD和GR水平低于CON組（Plt;0.01）；IH+TEMPOL+GSH組MDA水平低于IH組，SOD及GR水平高于IH組（Plt;0.01）；IH組、IH+TEMPOL組和IH+GSH組MDA、SOD和GR水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表2。

2.3 各組小鼠胰腺β細(xì)胞凋亡率的比較 IH組胰腺β細(xì)胞凋亡率高于CON組，IH+TEMPOL+GSH組胰腺β細(xì)胞凋亡率低于IH組、IH+TEMPOL組和IH+GSH組（Plt;0.01），IH+TEMPOL組、IH+GSH組與IH組胰腺β細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2、圖1。

Table 2 Comparison of oxidative stress indicators and the pancreatic β-cell apoptosis between five groups表2 各組小鼠胰腺氧化應(yīng)激指標(biāo)及β細(xì)胞凋亡率的比較（n=10，x±s）

3 討論

3.1 OSA（或IH）并發(fā)IR和（或）2型糖尿病的機(jī)制 OSA（或IH）是IR和（或）2型糖尿病一種新的危險因素，其發(fā)生糖代謝異常可能有多種病理生理機(jī)制，氧化應(yīng)激的增加是其中的重要機(jī)制之一，OSA患者的胰腺損傷與IH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)，并且依賴于活性氧（reactive oxygen species，ROS）的毒性作用。

3.2 抗氧化劑TEMPOL和GSH的抗氧化作用及其機(jī)制 研究表明抗氧化劑TEMPOL（SOD模擬劑）通過減輕氧化應(yīng)激可有效阻止IH大鼠活性氧自由基誘導(dǎo)的持續(xù)血壓增高[5]，亦可減輕骨骼肌微血管對去甲腎上腺素能的血管收縮反應(yīng)和肌源性活動[6]。GSH是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化物之一，通過非酶反應(yīng)及連接谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）可以減輕自由基損傷作用，在多種組織和動物模型中GPx的缺乏可產(chǎn)生許多有害作用。GSH可有效阻止IH時舒張壓升高，其舒張壓的增高是由于氧化應(yīng)激造成的，也可部分阻止脂質(zhì)誘導(dǎo)的整體IR。有研究報道聯(lián)合應(yīng)用抗氧化劑TEMPOL和GSH可抑制C57BL/6J小鼠由于靜脈輸入脂肪乳誘導(dǎo)的整體和骨骼肌IR，幾乎完全逆轉(zhuǎn)了氧化應(yīng)激，而單獨(dú)應(yīng)用TEMPOL或GSH則無明顯作用[7]。

3.3 抗氧化劑TEMPOL和GSH對OSA（或IH）的意義 本研究證實(shí)TEMPOL和GSH的聯(lián)合應(yīng)用可減輕IH時氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕胰腺β細(xì)胞凋亡及IR，而單獨(dú)應(yīng)用其中任何一種未能有效地減輕氧化應(yīng)激，逆轉(zhuǎn)IH誘導(dǎo)的胰腺損傷。其機(jī)制為SOD和GPx是ROS的關(guān)鍵清除劑，即TEMPOL清除O2-，GSH鈍化H2O2。該研究提示氧化應(yīng)激是IH胰腺損傷的主要原因，因此，氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)可以對IH時氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰腺損傷提供有效地保護(hù)治療，為OSA患者的藥物治療提供新的契機(jī)。

Figure 1 Comparison of apoptotic rates of pancreatic β-cells between five groups（TUNEL,×200）圖1 各組小鼠胰腺β細(xì)胞凋亡率的比較（TUNEL染色,×200）

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