李洪林 尹利榮 孫俊杰

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在 女性惡性腫瘤中居第二位，且近年來發(fā)病呈年輕化趨勢，是嚴(yán)重危害婦女健康和生命的惡性腫瘤。宮頸癌是由癌前病變，即宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalin?traepithelial neoplasia，CIN）逐步發(fā)展形成。人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)性感染是導(dǎo)致CIN及宮頸癌的主要原因，中國人群中高危型HPV（HR-HPV）感染在CIN及宮頸癌發(fā)病中的作用已基本得到公認(rèn)。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）是人端粒酶復(fù)合物的核心成分之一，其基因表達(dá)狀態(tài)是細(xì)胞調(diào)控端粒酶活性的主要環(huán)節(jié)，hTERT在細(xì)胞永生化中起重要作用。但目前關(guān)于hTERT基因在宮頸病變中擴(kuò)增情況的研究較少，而且宮頸病變中hTERT基因擴(kuò)增與HR-HPV感染的相關(guān)性報道更少，本實驗應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in si?tu hybridization，F(xiàn)ISH）檢測hTERT基因在CIN及宮頸癌中的擴(kuò)增情況，研究宮頸病變中hTERT基因擴(kuò)增與HR-HPV感染的相關(guān)性，為CIN的早期篩查、診斷、預(yù)測病變提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 連續(xù)入選2012年9月—2013年4月于我院婦科就診的CIN及宮頸癌患者118例（實驗組），其中CINⅠ級31例，CINⅡ級33例，CINⅢ級34例，宮頸癌20例；取其宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本。選取34例正常的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本為對照組，均無先天性遺傳病、嚴(yán)重內(nèi)科疾病及其他部位腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 HPV DNA檢測 所有研究對象均行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）-反向雜交芯片法檢測HPV DNA分型，試劑盒購自港龍生物技術(shù)（深圳）有限公司。

1.2.2 FISH檢測hTERT基因擴(kuò)增情況 （1）探針來源。hTERT探針購于KREATECH公司，為hTERT/CDC25C/EGR1 DNA探針。hTERT DNA探針雜交到5號染色體5p 15.3，熒光信號為紅色（PlatinumBright 550）,CDC25C/EGR1 DNA(對照探針)雜交到5號染色體5q 31.2，熒光信號為綠色(Platinum?Bright 495),呈雙色探針。（2）FISH操作。用薄層液基細(xì)胞學(xué)宮頸刷采集宮頸脫落細(xì)胞固定于載玻片上制片，于室溫放置過夜。玻片置于37 ℃ 2×SSC（pH7.0）液中漂洗2 min；在0.01 mol/L HCl配置成的0.005%胃蛋白酶溶液中溫育15 min（37℃）；1×PBS液中漂洗3 min（室溫）；1×PBS液配置成的1%甲醛溶液中固定10 min（室溫）；再次1×PBS液中漂洗3 min（室溫）；分別于70%、85%和100%乙醇梯度脫水固定，室溫下自然干燥玻片。避光環(huán)境下每22 mm×22 mm雜交區(qū)域滴加10 μL探針混合，加蓋玻片，橡皮膠封邊，于75℃共變性10 min，37℃保溫箱過夜雜交。第2天移去蓋玻片，立即將玻片置于0.4×SSC溶液中，溫度（72±1）℃ 2 min；再置于2×SSC溶液中漂洗1 min（室溫）；最后分別于70%、85%和100%乙醇梯度脫水1 min固定，室溫下暗處自然干燥玻片，加15 μL DAPI復(fù)染劑，加蓋玻片，暗處放置20～30 min。（3）結(jié)果分析。FISH信號判斷應(yīng)用OLYMPUS B×51型熒光顯微鏡在DAPI/FIFC/Texas Red三色濾光鏡激發(fā)下，觀察間期細(xì)胞熒光雜交信號，用Video－Test公司提供的FISH分析軟件進(jìn)行圖像分析。正常細(xì)胞單個間期細(xì)胞核中紅色及綠色信號各為2

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組總體均數(shù)比較用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗。計數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，多組比較檢驗水準(zhǔn)α=0.05，進(jìn)一步兩兩比較時檢驗水準(zhǔn)α=0.005。個。hTERT基因擴(kuò)增異常細(xì)胞單個間期細(xì)胞核中紅色信號大于3個，綠色信號2個。每例分析200個間期細(xì)胞核，對各通道下均顯示清晰可辨的、孤立的、雜交信號明顯的細(xì)胞核進(jìn)行計數(shù)，并計算其所占百分比。對重疊、破損、輪廓不清的不計數(shù)，微弱雜交信號者不計數(shù)。細(xì)胞內(nèi)雜交信號互相靠近者計為1個信號。閾值建立:采集20例正常人宮頸脫落細(xì)胞，使用上述方法進(jìn)行FISH實驗，每例分析至少200個細(xì)胞，統(tǒng)計出異常hTERT信號細(xì)胞數(shù)目的百分比。異常閾值=均數(shù)+3×標(biāo)準(zhǔn)差。本研究中異常閾值為0。結(jié)果判斷：根據(jù)閾值判斷結(jié)果。每例樣本任意計數(shù)200個細(xì)胞，如果異常細(xì)胞≥1，判定為陽性結(jié)果；如果異常細(xì)胞數(shù)為0，判定為陰性結(jié)果；對于不明確的異常細(xì)胞，則加大觀測樣本細(xì)胞數(shù)目，以判斷最后結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 5組年齡比較 宮頸癌組的年齡大于對照組、CIN Ⅰ級、CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級組（Plt;0.05），其他4組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

Table 1 Comparison of average age,HR-HPV infection and hTERT amplification between five groups表1 各組年齡、HR-HPV感染及hTERT基因擴(kuò)增情況比較

2.2 5組HR-HPV DNA陽性率比較 共檢出20種HR-HPV：HPV16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，67，68，69，73，82。CIN Ⅱ級、CINⅢ級、宮頸癌組的HR-HPV DNA陽性比例高于對照組(Plt;0.005)，正常組與CINⅠ級組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.3 5組hTERT基因擴(kuò)增陽性率比較 實驗組與對照組宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本hTERT/CDC25C/EGR1 DNA探針雜交后，均可清晰看到紅色及綠色的探針雜交信號亮點,見圖1、2。宮頸癌組的hTERT基因擴(kuò)增陽性率高于正常組、CINⅠ級、CINⅡ級組（Plt;0.005）。宮頸癌與CINⅢ級組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.005），見表1。hTERT基因擴(kuò)增陽性與HR-HPV感染陽性之間呈正相關(guān)(r=0.238，Plt;0.05)，見表2。

Figure 1 The exfoliated cervical nucleus without abnormal hTERT amplification（×1 000）圖1 hTERT基因無異常擴(kuò)增的宮頸脫落細(xì)胞核（×1 000）

Figure 2 The exfoliated cervical nucleus with abnormal hTERT amplification（×1 000）圖2 hTERT基因異常擴(kuò)增的宮頸脫落細(xì)胞核（×1 000）

Table 2 Correlation analysis between hTERT amplification and HR-HPV infection表2hTERT基因擴(kuò)增與HR-HPV感染的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 HR-HPV感染與宮頸病變關(guān)系 已有較多研究得出結(jié)論HR-HPV感染是引起宮頸癌的重要誘因之一[1]，本研究結(jié)果提示，隨著宮頸病變級別的升高，HR-HPV DNA陽性率逐漸增高，對照組分別與CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌組比較，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而對照組與CINⅠ級相比無明顯差異，說明HR-HPV感染在大多數(shù)婦女中是暫時的，HPV感染是可逆的，只有持續(xù)的感染，最終HPV DNA整合入宿主染色體導(dǎo)致宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，CINⅠ級作為低級別上皮內(nèi)瘤變，屬于可逆性病變，可能是HRHPV感染后的早期時間，與宿主的惡性轉(zhuǎn)化無關(guān)。

3.2 hTERT基因與宮頸病變的關(guān)系 人端粒酶是由hTERT、端粒mRNA（hTERC）及端粒酶結(jié)合蛋白(hTP1)組成。端粒酶的意義是通過端粒的作用來實現(xiàn)的，端粒是真核細(xì)胞染色體的末端物質(zhì)，有分裂鐘之稱，端粒DNA序列高度保守，在維持染色體穩(wěn)定性中起重要作用。研究證實端粒酶基因的激活出現(xiàn)在85%～90%的癌細(xì)胞中，其作用是保持端粒的長度和結(jié)構(gòu)，使癌變細(xì)胞永生化[2]。hTERT是端粒酶的限速酶，它屬于逆轉(zhuǎn)錄酶家族的成員，其編碼基因位于染色體5p上，能以hTERC為模板合成端粒序列以穩(wěn)定端粒長度使細(xì)胞獲得永生。hTERT基因主要表達(dá)于癌細(xì)胞中，正常細(xì)胞不表達(dá)或僅有少量表達(dá)。Oikonomou等[3]研究表明，端粒酶的激活可能是宮頸癌發(fā)生的早期事件。Anedchenko等[4]對宮頸癌細(xì)胞和組織的檢測發(fā)現(xiàn)，hTERT基因的表達(dá)與端粒酶的活性密切相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示hTERT基因擴(kuò)增陽性率隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的加重而逐漸增高，對照組中hTERT基因無異常擴(kuò)增，早期宮頸病變中hTERT基因擴(kuò)增的陽性率較低，宮頸癌組hTERT基因擴(kuò)增的陽性率明顯高于對照組、CINⅠ級、CINⅡ級，而宮頸癌組與CINⅢ級無明顯差異，表明CINⅠ/Ⅱ級屬于低危性病變，當(dāng)宮頸病變發(fā)展到CINⅢ級和宮頸癌時，hTERT基因異常擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)增多并且基因拷貝數(shù)增加，從而使端粒酶活性增強(qiáng)，使染色體端粒維持在一定長度而獲得永生和無限增值，進(jìn)而提示hTERT基因擴(kuò)增與早期宮頸病變及其進(jìn)展有關(guān)。因此，應(yīng)用FISH技術(shù)檢測hTERT基因擴(kuò)增情況不僅可作為宮頸癌前病變的臨床醫(yī)學(xué)檢測的輔助指標(biāo)，而且可以用來預(yù)測低危性病變CINⅠ/Ⅱ是否進(jìn)展。

3.3 HR-HPV感染與hTERT基因在宮頸病變中的關(guān)系 因為僅少數(shù)HPV感染者最終發(fā)展為宮頸癌，所以HPV感染不是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的唯一致病因素[5]，還有其他致病因素共同導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，本研究評估在宮頸病變進(jìn)展過程中，hTERT基因擴(kuò)增與HR-HPV感染的相關(guān)性，結(jié)果表明HR-HPV陽性率高于hTERT基因擴(kuò)增的陽性率，而hTERT基因擴(kuò)增陽性的宮頸病變中，大多數(shù)是HR-HPV感染，因此推測HPV感染早于hTERT基因的擴(kuò)增，兩者在病變發(fā)展過程中有時序性差異，即繼發(fā)于HR-HPV感染的宮頸病變?nèi)孕鑘TERT基因的異常擴(kuò)增，兩者協(xié)同導(dǎo)致宮頸病變的加重。但是HR-HPV感染并不都伴有hTERT基因的擴(kuò)增，hTERT基因的擴(kuò)增并不均伴有HR-HPV的感染，兩者也存在一定的獨(dú)立性，也就是說，HR-HPV感染具有可逆性，多發(fā)生在癌前病變早期，而HR-HPV DNA整合是不可逆的，病毒整合和hTERT基因擴(kuò)增多發(fā)生在癌前病變中晚期，HR-HPV整合到宿主基因組，從而導(dǎo)致hTERT基因異常擴(kuò)增，或者HR-HPV整合伴隨染色體不穩(wěn)定的發(fā)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，其機(jī)制需進(jìn)一步研究。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)端粒酶的激活是HR-HPV感染宮頸組織后由CIN向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化過程中相當(dāng)關(guān)鍵的步驟[6]。Baege等[7]用HPV E6/E7轉(zhuǎn)染宮頸上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染晚期（第30天）比轉(zhuǎn)染早期（第4天）的hTERT基因水平升高25倍，說明HPV感染影響hTERT的表達(dá)。Theelen等[8]認(rèn)為，HPV16/18 DNA整合到宮頸上皮細(xì)胞，使hTERT基因異常擴(kuò)增。Van Doorslaer等[9]研究發(fā)現(xiàn)，HPV 16E6蛋白激活端粒酶hTERT基因的啟動子，使其表達(dá)增強(qiáng)活性增高。關(guān)于宮頸病變中hTERT mRNA、蛋白與HR-HPV感染的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

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