李曉洲 劉 靜 史云芳 琚 端 李 巖 張 穎 岳天孚

18-三體綜合征（edwards syndrome，ES）是人類常見的染色體病，無法治療，只能通過產(chǎn)前診斷避免患兒出生，但傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，培養(yǎng)時間長，不能滿足產(chǎn)前診斷需要。且目前產(chǎn)前診斷的需求增大較快，因此快速產(chǎn)前診斷方法的建立迫在眉睫。短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem re?peat，STR）的多態(tài)性較豐富，定量熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative fluorescence polymerase chain reac?tion，QF-PCR）靈敏、快捷且自動化的特點[1]，兩者結(jié)合可作為快速基因診斷染色體數(shù)目異常的首選方法。但由于國內(nèi)缺乏18號染色體STR基因座的遺傳學(xué)信息，因此很難實現(xiàn)對ES快速基因診斷，尤其限制其在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。本研究應(yīng)用QF-PCR技術(shù)研究天津漢族胎兒18號染色體上D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座遺傳多態(tài)性，為ES的快速產(chǎn)前基因診斷提供實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 64例絨毛和374例羊水樣本取自2004年4月—2009年10月于我院產(chǎn)前診斷中心就診的438例高危妊娠婦女，孕周8～24周，均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取絨毛0.5～1 mg或羊水1 mL，按本室常規(guī)方法提取DNA。

1.2.2 引物選擇 根據(jù)NCBI的UniSTS數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists），選擇 D18S53、D18S59和 D18S488 3個STR基因座并確定引物序列。正向引物5′端均由熒光染料 5-羧基-熒光素（caboxyfluorescein-5-succimidyl ester，F(xiàn)AM）標記，引物序列由北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司合成，見表1。

1.2.3 PCR 擴增 PCR 反 應(yīng) 體 系 25 μL：1×PCR buffer，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq酶0.04 U/μL，模板DNA約0.6 ng，引物濃度為0.12 μmol/L。PCR擴增條件：預(yù)變性94℃2 min；變性94℃30 s，退火52℃30 s，延伸72℃1 min，共35個循環(huán)；延伸72℃10 min，4℃保存。

1.2.4 PCR擴增產(chǎn)物檢測 PCR反應(yīng)結(jié)束后，4%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，ABI PRISM 377自動測序儀掃描電泳圖，用GeneScan 3.1軟件進行數(shù)據(jù)提取，安裝膠圖的Matrix文件，選擇合適內(nèi)標并設(shè)置合適的分析參數(shù)，打開Binthere軟件，設(shè)置片段大小范圍，并把GeneScan 3.1軟件分析得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入，得到膠圖對應(yīng)的峰圖及相關(guān)數(shù)據(jù)。根據(jù)分子內(nèi)標記電泳位置，分析出電泳的DNA片段的大小及熒光信號峰面積。將等位基因片段由小到大順序排列并編號，據(jù)此得到各樣本的基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行分析，驗證是否符合H-W平衡定律（P＞0.05）。對表現(xiàn)為雜合子的個體，統(tǒng)計其峰面積比值的均數(shù)、標準差及95%參考值范圍。采用PowerStatsV12軟件進行統(tǒng)計分析，分別計算3個STR基因座的觀察雜合度（heterozygosity of observation，Ho）、多態(tài)信息量（polymorphism information content，PIC）、個體識別率（proba?bility of discrimination power，DP）、非父排除率（probability of exclusion，PE）等群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 3個基因座基因頻率分布 438例樣本均擴增成功。D18S53 STR基因座共發(fā)現(xiàn)15種等位基因，片段長度為161～185 bp，由小到大依次命名為1～15，共發(fā)現(xiàn)52種基因型，分布符合H-W定律（χ2=23.94，P=1.00）。D18S59 STR基因座共發(fā)現(xiàn)13種等位基因，片段長度為128～152 bp，由小到大依次命名為1～13，共發(fā)現(xiàn)47種基因型，分布符合H-W定律（χ2=52.10，P=0.19）。D18S488 STR基因座共發(fā)現(xiàn)15種等位基因，片段長度為236～264 bp，由小到大依次命名為1～15，共發(fā)現(xiàn)42種基因型，分布符合H-W定律（χ2=45.11，P=0.23）。3個STR基因座等位基因頻率見表2，基因座電泳圖，見圖1。438例樣本的3個STR基因座共1 067個樣本表現(xiàn)為雜合子，2個峰的峰面積比值為0.50～1.76，x=1.06，s=0.21，95%CI：0.65～1.47，見圖2～4。

Table 2 The allele frequencies of STR loci D18S53,D18S59 and D18S488表2 D18S53、D18S59和D18S488 STR基因座等位基因頻率

2.2 遺傳多態(tài)性統(tǒng)計 天津漢族胎兒D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座Ho、PIC、DP和PE等群體多態(tài)性數(shù)據(jù)見表3。

3 討論

STR基因座即微衛(wèi)星DNA，重復(fù)次數(shù)通常為15～30次。一般1個STR基因座有十幾個等位基因片段，其長度范圍約在400 bp以下，其核心序列多為(TG)n、(AAT)n、(GATA)n等，以(CA)n最常見，多存在于非翻譯區(qū)及內(nèi)含子中。由于STR基因座的高度多態(tài)性及孟德爾共顯性遺傳等特點使其廣泛用于基因作圖、篩選目的基因、遺傳病連鎖分析、群體遺傳學(xué)研究、法醫(yī)個體識別和親權(quán)鑒定等方面。1991年Ed?wards等[2]首次應(yīng)用STR-PCR建立第二代DNA指紋技術(shù)用以診斷X染色體單體疾病。1993年Mansfield等[3]首先以STR基因座作為21號染色體的遺傳標記，用QF-PCR對唐氏綜合征患者進行基因診斷，此后陸續(xù)有學(xué)者利用STR基因座的獨特優(yōu)勢進行染色體數(shù)目異常診斷。

Table 1 The characteristics of STR loci D18S53,D18S59and D18S488表1 D18S53、D18S59和D18S488基因座特征

Figure 1 Electrophoresis result of D18S53,D18S59 and D18S488 STR loci圖1 D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座電泳圖

Figure 2 Results of GeneScan analysis of D18S53 STR locus圖2 D18S53 STR基因座GeneScan分析結(jié)果圖

Figure 3 Results of GeneScan analysis of D18S59 STR locus圖3 D18S59 STR基因座GeneScan分析結(jié)果圖

Figure 4 Results of GeneScan analysis of D18S488 STR locus圖4 D18S488 STR基因座GeneScan分析結(jié)果圖

Table 3 The genetic polymorphism data of three STR loci表3 3個STR基因座遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)

QF-PCR在英國乃至歐美國家已經(jīng)廣泛應(yīng)用于常見染色體非整倍體的快速診斷[4]，Hills等[5]回顧分析倫敦地區(qū)9 737例產(chǎn)前診斷樣本，發(fā)現(xiàn)73例母血污染嚴重的樣本單獨應(yīng)用QF-PCR可明確診斷。由于國內(nèi)缺少相關(guān)的科研數(shù)據(jù)，因此還無法將QFPCR應(yīng)用于常見染色體非整倍體的快速診斷中。本研究分別選取18號染色體著絲粒附近、短臂和長臂各1個STR基因座，通過研究其群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為天津漢族群體ES基因診斷及產(chǎn)前基因診斷的研究提供實驗依據(jù)；并且通過對QF-PCR結(jié)果峰面積定量的統(tǒng)計分析，為建立應(yīng)用該方法進行基因診斷及產(chǎn)前基因診斷的標準提供實驗依據(jù)。

目前國內(nèi)外有關(guān)D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)鮮有報道，本研究結(jié)果顯示，天津漢族胎兒這3個STR基因座Ho、PIC、DP及PE值與本課題組前期有關(guān)天津漢族群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)一致[6]。一般認為所選取的STR基因座若Ho＞0.7、PIC＞0.5、DP＞0.8且PE＞0.5，則可作為良好的遺傳標記，故本研究選取的D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座可作為18號染色體良好的遺傳標記，進一步用于ES的產(chǎn)前基因診斷。

QF-PCR以其經(jīng)濟、高效的特點一直受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。Gekas等[8]通過對110 948例孕婦產(chǎn)前診斷方案的研究發(fā)現(xiàn)，QF-PCR方法每診斷1例DS比核型分析可節(jié)約3 494美元。因此有必要建立符合天津地區(qū)人群特點的QF-PCR診斷方案。由于相同STR基因座在不同個體可能出現(xiàn)不同長度的等位基因，則QF-PCR擴增STR后可能出現(xiàn)2種情況：純合子表現(xiàn)為1條帶/峰；雜合子表現(xiàn)為2條帶/峰，定量之比約為1∶1。本研究3個STR基因座共1 067個樣本表現(xiàn)為雜合子，2個峰的峰面積比值為0.50～1.76，x=1.06，s=0.21，95%CI：0.65～1.47，與Faas等[9]的研究結(jié)果一致。

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