張想旺，隋友樂，王春波，戰(zhàn)激光，管麗麗，馬守江

土荊皮 （Cortex Pseudolaricis）來源于松科植物金錢松（Pseudolarixkaempferi Gord）的根皮和近根樹皮，性辛溫，有毒，用于治療手足癬、神經(jīng)性皮炎、濕疹等［1］。其醇提物與苯甲酸、水楊酸制成的復(fù)方土荊皮酊具有良好的止癢、抗真菌的作用，廣泛用于手足癬、體癬的治療。最新研究表明，土荊皮中特征性的二萜酸類成分是其抗真菌、抗腫瘤、抗生育和抗血管生成的主要有效成分，其中土荊皮乙酸（pseudolaric acid B，PAB）含量最高、活性最強(qiáng)［2－5］。目前，土荊皮乙酸通常采用乙醇浸漬法提取，該方法提取效率低下，有效成分提取不完全。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)國內(nèi)對(duì)土荊皮乙酸的醇提取工藝缺乏系統(tǒng)研究，為此，筆者建立高效液相（HPLC）法測(cè)定土荊皮乙酸的含量，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化土荊皮乙酸的醇提工藝，比較三種提取方法對(duì)土荊皮乙酸提取率的影響。

1 儀器與試藥

LC－10AT 型 HPLC 儀 （日本島津公司）；AB135－S型，1／100 000電子天平 （瑞士梅特勒－托利多公司）；KQ－500E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器廠）；RE－2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）；搖擺式高速藥材調(diào)料粉碎機(jī)（溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠）。土荊皮乙酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：201003）；土荊皮藥材（購自安徽德昌藥業(yè)飲片有限公司，產(chǎn)地：湖北，批號(hào)：120912）；乙腈、乙醇、丙酮、甲醇均為色譜純，水為超純水。

2 樣品含量測(cè)定

2．1 色譜條件 色譜柱：InersilODS－3（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－水－三氟乙酸（500∶500∶1）；流速 1．0 ml／min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量20 μl。此色譜條件下，土荊皮乙酸與提取物中其他成分有較好的分離度。對(duì)照品與供試品的保留時(shí)間一致（9．87 min），供試品土荊皮乙酸能夠較好分離，對(duì)照品以及供試品的色譜圖見圖1。

圖1 土荊皮乙酸樣品含量高效液相色譜圖

2．2 溶液的制備

2．2．1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥12 h的土荊皮乙酸對(duì)照品6．42 mg，置100 ml量瓶中，甲醇定容（作為儲(chǔ)備液），搖勻，精密吸取1 ml置10 ml量瓶中甲醇定容，得濃度為 6．42 μg／ml的對(duì)照品溶液。

2．2．2 供試品溶液的制備 精密稱取土荊皮粉末 （過三號(hào)篩）0．5 g，置于 10 ml燒杯中加水 5 ml，浸泡 2 h，加入 90%乙醇溶液6 ml，按照正交設(shè)計(jì)條件分別提取，過濾，洗滌甲醇5 ml×3，合并濾液、洗滌液，轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中丙酮定容，即得。

2．3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取 2．2．1項(xiàng)下儲(chǔ)備溶液0．5、1．0、4．0、6．0、8．0、10．0 ml置于 10 ml量瓶中甲醇定容，得到 3．21、6．42、38．52、51．36、64．2 μg／ml溶液。按 2．1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝3．4087×103X＋6．025×103，r＝0．9998。結(jié)果表明土荊皮乙酸濃度在 3．21～64．2 μg／ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2．4 精密度實(shí)驗(yàn) 取土荊皮乙酸對(duì)照品溶液 （6．42 μg／ml）按“2．1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣 6 次，20 μl／次。結(jié)果，RSD＝1．19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2．5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，在上述色譜條件下分別于 0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣 1 次，20 μl／次，記錄峰面積，RSD為2．12%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批 （批號(hào)：120912）樣品6份，每份約 0．5 g，按“2．2．2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，精密吸取 20 μl，按照“2．1”色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)定含量。土荊皮乙酸的含量分別為 0．40%、0．43%、0．41%、0．38%、0．37%、0．42%，均值 0．40%，RSD 為 2．11%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2．7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知土荊皮乙酸含量的土荊皮（批號(hào)：120912）9 份，約 0．5 g／份，按照不同提取方法分3組，3份／組，分別精密加入土荊皮乙酸對(duì)照品溶液0．8、1．0、1．2 ml，按照“2．2．2”項(xiàng)下方法分別處理，測(cè)定含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率分別為 100．75%、100．67%、103．58%，RSD 分別為 2．48%（n＝3）、1．66%（n＝3）、2．32%（n＝3），表明三種方法回收率良好。見表1。

表1 加樣回收率考察結(jié)果

2．8 樣品分析 樣品提取率測(cè)定按照“2．2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“2．1”色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，利用線性方程計(jì)算土荊皮乙酸的含量

3 實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化

3．1 滲轆法正交設(shè)計(jì) 用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選滲轆法最佳提取工藝，選用影響提取效果的乙醇提取液濃度（A）、固液比（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，每個(gè)因素各選3個(gè)水平，以土荊皮乙酸提取率為指標(biāo)，按正交設(shè)計(jì)L9（34）表進(jìn)行土荊皮乙酸滲漉提取實(shí)驗(yàn)。因素水平見表2；正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3；方差分析結(jié)果見表4。比較極差，選擇的提取條件為A3B3C2，以90%乙醇為提取溶劑，提取48 h，滲轆提取2次。

表2 滲轆法提取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表3 滲轆法提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 滲轆法提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

3．2 超聲法正交設(shè)計(jì) 用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選超聲法最佳提取工藝，選用影響提取效果的乙醇提取液濃度（A）、固液比（B）、超聲時(shí)間（C）為考察因素，每個(gè)因素各選3個(gè)水平，以土荊皮乙酸提取率為指標(biāo)，按正交設(shè)計(jì)L9（34）表進(jìn)行土荊皮乙酸提取實(shí)驗(yàn)。提取工藝正交設(shè)計(jì)因素水平見表5；正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6；正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析見表7。比較極差，選擇提取條件為A3B3C2，即提取液濃度90%，固液比1∶12，超聲提取時(shí)間20 min。

表5 超聲波醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表6 超聲波醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 超聲波醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

3．3 回流法正交設(shè)計(jì)用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選回流法最佳提取工藝，選用影響提取效果的乙醇提取溶劑（A）、提取時(shí)間（B）和提取次數(shù)（C）為考察因素，每個(gè)因素各選3個(gè)水平，以土荊皮乙酸提取物回收率為指標(biāo)，按正交設(shè)計(jì)L9（34）表進(jìn)行土荊皮乙酸提取實(shí)驗(yàn)。因素水平見表8；正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9；方差分析結(jié)果見表10。比較極差，選擇醇提條件為A1B1C3即提取液濃度60%，固液比1∶8，提取時(shí)間60 min。

3．4 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 精密稱取土荊皮粉末0．3 g按最佳醇提工藝重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，分別按照正交優(yōu)選的最佳提取條件即：滲漉法（A3B3C2）、超聲波提取法（A3B3C2）、回流法（A3B1C3）進(jìn)行工藝驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果見表11。

表8 回流醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表9 回流醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表10 回流醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

表11 不同醇提工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

4 討 論

本文采用的 HPLC法測(cè)定土荊皮乙酸含量，是參照中國藥典2010年版一部土荊皮項(xiàng)下的方法，流動(dòng)相做了適當(dāng)調(diào)整，能達(dá)到有效分離，峰型好。標(biāo)準(zhǔn)曲線研究顯示土荊皮乙酸進(jìn)樣量在 3．21～64．2 μg／ml范圍內(nèi)線性關(guān)系較好［6－8］。

本實(shí)驗(yàn)采用滲漉、超聲波、回流三種提取方法，選用價(jià)格相對(duì)較低、毒性小的乙醇作為溶劑，考察不同提取方法對(duì)土荊皮乙酸提取率的影響。結(jié)果顯示在最佳提取條件下三種方法均能較完全的提取土荊皮中土荊皮乙酸，其中超聲波提取具有操作簡(jiǎn)單，提取效率高；滲漉法提取溶劑消耗量大，能耗高但更適合大批量的提?。?］。

為全面研究土荊皮乙酸的提取方法，筆者亦采用水煮醇沉法。發(fā)現(xiàn)土荊皮乙酸色譜峰出現(xiàn)明顯的肩峰，筆者認(rèn)為過高溫度（100℃）能使土荊皮乙酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其原因可能與分子內(nèi)內(nèi)酯環(huán)的穩(wěn)定性有關(guān)［10］。本文結(jié)果表明，水浴加熱在80～82℃，回流提取60 min未見明顯肩峰，表明在該溫度范圍內(nèi)土荊皮乙酸穩(wěn)定性較好，可用于土荊皮乙酸的提?。?1］。

［1］徐云輝，張 帥，張 念，等．土荊皮抗真菌化學(xué)成分研究［J］．中草藥，2012，43（2）：220．

［2］劉 鵬，徐 曼，郭洪祝，等．土荊皮乙酸的代謝產(chǎn)物和代謝途徑［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（11）：1361－1365．

［3］李晨光．土荊皮乙酸抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展［J］．天津藥學(xué)，2001，13（6）：9－10．

［4］宋永峰，陳 虹，李靈芝．土荊皮的研究進(jìn)展［J］．天津藥學(xué)，2001，13（6）：9－10．

［5］侯 麗，崔景榮．土荊皮乙酸抗腫瘤作用及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展［J］．中國藥學(xué)雜志，2010，45（23）：1810－1812．

［6］陳 樺，馮柏康，李艷園，等．高效液相色譜法測(cè)定土荊皮藥材中土荊皮乙酸的含量［J］．中藥材，2006，29（5）：451．

［7］焦守國，許學(xué)麗．HPLC法測(cè)定金烏骨通膠囊中淫羊藿苷的含量［J］．解放軍藥學(xué)報(bào)，2009，25（6）：547．

［8］張強(qiáng)祖，楊 進(jìn)．反相高效液相色譜法測(cè)定茄根中綠原酸含量［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（6）：1342－1343．

［9］童 玲，歐陽湘云，韓玉波，等．微波助提取及HPLC檢測(cè)杜仲葉中的綠原酸［J］．分析試驗(yàn)室，2008，27（5）：127．

［10］何錦鈞，陳 華．正交試驗(yàn)優(yōu)選通淋口服凍干顆粒的提取工藝［J］．中藥材，2010，33（5）：813－815．

［11］國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典（一部）［S］．中國醫(yī)藥科技出版社，2010．17．