王麗曄 林 參 趙海蘋 張陳誠 閆 峰 陳志剛 王榮亮 王寧群 羅玉敏*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京100053;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院東方醫(yī)院腦一科，北京100078)

慢性腦缺血是臨床常見病、多發(fā)病，且遷延日久使腦組織出現(xiàn)神經(jīng)元變性、膠質(zhì)細(xì)胞增生等一系列改變，伴隨出現(xiàn)認(rèn)知障礙等癥狀，也是Binawanger病、缺血性卒中等多種疾病發(fā)生過程的重要環(huán)節(jié)。目前是神經(jīng)病學(xué)及神經(jīng)科學(xué)眾多學(xué)者的重點研究方向，但其動物研究模型制作方法及制作時間具有很大爭議［1-2］。本研究選用國際常用的大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(permanent，bilateral common carotid artery occlusion，BCCA)模型稍做改良，選取42 d及56 d兩個時間點，通過觀察其認(rèn)知、情緒的行為學(xué)改變，小膠質(zhì)細(xì)胞及大體組織狀態(tài)變化確定評估時間點，在模型制作時間上為慢性腦缺血實驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量280～300 g，購于北京維通利華實驗動物公司，實驗動物許可證號:SCXK(京)2012-0001。分籠飼養(yǎng)于SPF級動物室，造模前12 h禁食不禁水。大鼠造模后采用抽簽法隨機(jī)分為4組:42 d-Sham(n=12)、42 d-Model(n=18)、56 d-Sham(n=12)及56 d-Model(n=18)。

1.2 主要儀器及試劑

大鼠手術(shù)操作臺、小動物呼吸機(jī)(美國Harvard Apparatus 683)、顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、顯微手術(shù)器械、搖床(江蘇TS-1/TS-8)、免疫熒光顯微鏡(日本 Nikon digital imaging hero eclipse 80i)、化學(xué)發(fā)光儀(上海 Chemi Scope)。

蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)、Anti Iba1(Wako公司，日本)、Anti NeuN(Millipore公司，美國)、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG及Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 動物模型制作方法

所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d后，采用Torre的方法［3］復(fù)制慢性腦缺血大鼠模型。大鼠稱質(zhì)量后用5%恩氟烷混合70%N2O、30%O2誘導(dǎo)麻醉，1% ～2%恩氟烷混合70%N2O、30%O2維持麻醉。仰位固定，常規(guī)備皮，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈、迷走神經(jīng)，分別于剝離出的頸總動脈近心端及遠(yuǎn)心端用“4”號手術(shù)線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈2次，完全阻斷頸總動脈血流。術(shù)中肛溫保持在36.5～37.5℃，縫合皮膚后放回動物房飼養(yǎng)。Sham組只分離雙側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎，其余處理同手術(shù)組。

1.4 行為評估方法

利用Morris水迷宮和新舊物體識別實驗對大鼠認(rèn)知能力進(jìn)行評價，利用曠場試驗對大鼠行為狀態(tài)及情緒狀態(tài)進(jìn)行評價。

1.4.1 Morris水迷宮行為測試

1.4.2 新舊物體識別

取材前3 d進(jìn)行新舊物體識別試驗，參照Hattiangady等［5］試驗方法。分為適應(yīng)期、熟悉期及識別測試期，均以每只每天5 min進(jìn)行訓(xùn)練測試。適應(yīng)期為空場適應(yīng)，熟悉期將兩物體放置于空場內(nèi)使大鼠識別，測試期將熟悉期的兩物體之一換為新物體，并記錄大鼠在測試期內(nèi)對兩物體的探索時間(以嘴湊近物體約2 cm范圍內(nèi)計時，鼠爬在玩具上玩或者只是在物體附近走不計入)。定義(N-F)/(N+F)×100%為探索時間分辨指數(shù)(discrimination index，DI)，用來評價大鼠記憶能力，其中N指探索新物體時間，F(xiàn)指探索舊物體時間。

1.4.3 曠場試驗

于取材前1 d采用曠場實驗評定大鼠運動狀態(tài)及情緒表現(xiàn)。參照Xiong等［6］實驗方法，自制木質(zhì)曠場箱，長×寬×高為120 cm×120 cm×60 cm。內(nèi)側(cè)壁及底面為藍(lán)灰色，用不銹鋼線內(nèi)嵌劃分為24 cm×24 cm面積相等的25塊。實驗前先置大鼠于測試實驗室內(nèi)適應(yīng)5 min。次日觀察大鼠活動情況，記錄5 min內(nèi)大鼠總穿格數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)以及排便次數(shù)。

1.5 組織制備

分別在相應(yīng)時間點處死各組大鼠，即42 d-Model和42 d-Sham于造模后42 d處死大鼠，56 d-Model和56 d-Sham于造模后56d處死大鼠。經(jīng)10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛溶液3.5 mL/kg腹腔注射麻醉后，以0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液心臟灌注200 mL/只，斷頭取腦。于視交叉處將全腦切為前后兩部分，留取小腦方向的后部分，并浸泡于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液中固定3 d，后置于20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖溶液中脫水2 d，備用。

1.6 腦組織冰凍切片蘇木精-伊紅HE染色

用LeicaCM 1900型冰凍切片機(jī)，切取海馬處8 μm厚切片，HE染色。將冰凍切片先后經(jīng)4℃丙酮中固定10 min，蘇木精染色10 min，1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸和75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇分化數(shù)秒，水洗20 min返藍(lán)，伊紅染色30 s等步驟后，于乙醇梯度脫水及二甲苯中透明，并以樹膠封片完成。注意各步驟間水洗。高倍光鏡下觀察并通過攝像頭將鏡下圖像(×600)輸入計算機(jī)，觀察海馬部位的細(xì)胞狀態(tài)。

1.7 腦組織冰凍切片免疫熒光

用LeicaCM 1900型冰凍切片機(jī)，切取海馬處15 μm厚切片。4℃丙酮中固定10 min，1×PBS搖洗5 min×3次;3%小牛血清封閉非特異性抗原1.5 h，無需搖洗;滴加Iba1抗體2 h室溫孵育，1×PBS搖洗5 min×3次;避光操作Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫孵育30 min，1×PBS搖洗5 min×3次;DAPI封片后熒光顯微鏡下觀察及拍攝。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sE)表示，各數(shù)據(jù)組間比較使用單因素方差分析法和均數(shù)多重比較LSD法，水迷宮逃避潛伏期比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

(3)農(nóng)業(yè)環(huán)境質(zhì)量。農(nóng)業(yè)環(huán)境是指農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中影響農(nóng)業(yè)生物成長的各種自然因素或經(jīng)過人工改造后的自然因素的總體，由地形、土壤、生物因素、氣候、水及人為因素所組成。農(nóng)業(yè)環(huán)境是農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的基礎(chǔ)，我國地域遼闊，各區(qū)域農(nóng)業(yè)自然環(huán)境差異較大，如我國東部地區(qū)地勢平緩，季風(fēng)氣候雨熱同期，有著豐富的自然資源，有利于農(nóng)業(yè)的綠色發(fā)展，而我國西北地區(qū)地勢陡峭，自然環(huán)境惡劣，以溫帶大陸性氣候為主，降水稀少，水資源短缺，不利于農(nóng)作物的生長。本文使用各地區(qū)受災(zāi)面積(千公頃)與各地區(qū)耕地面積(千公頃)的比值表示農(nóng)業(yè)環(huán)境質(zhì)量，用x3表示。理論上，若某地區(qū)的受災(zāi)面積與耕地面積比重越大，則該地區(qū)農(nóng)業(yè)環(huán)境質(zhì)量越惡劣。

2 結(jié)果

2.1 慢性腦缺血對大鼠認(rèn)知功能影響

2.1.1 慢性腦缺血對大鼠Morris水迷宮結(jié)果的影響

1)不同時間點慢性腦缺血后逃避潛伏期比較:本研究比較了 42 d-Model、42 d-Sham、56 d-Model和 56 d-Sham 4組的逃避潛伏期，每一組逃避潛伏期都與訓(xùn)練時間呈負(fù)相關(guān)，即隨著時間的延長，逃避潛伏期逐漸減少。將42 d-Model和42 d-Sham組之間比較，第3天及第4天Model組逃避潛伏期較Sham組明顯延長(P＜0.05，圖1A);56 d-Model及56 d-Sham進(jìn)行比較，從第2天開始至第4天，2組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表現(xiàn)為Model組逃避潛伏期明顯延長(圖1B)。

2)不同時間點慢性腦缺血后空間探索實驗結(jié)果比較:在空間探索實驗中，本研究首先比較了42 d-Model、42 d-Sham、56 d-Model和 56 d-Sham 4 組的游泳速度，42 d、56 d 2時間點Model組和Sham組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，證明大鼠并無肢體運動功能障礙(圖1C);目標(biāo)象限路徑百分比比較中，兩時間點的Model組與Sham組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1D);而在穿越平臺次數(shù)的比較中，42 d及56 d Model組較其對應(yīng)的Sham組均有顯著減少(P＜0.05，圖1E)。

2.1.2 不同時間點慢性腦缺血后新舊物體識別實驗結(jié)果比較

為進(jìn)一步探討B(tài)CCA法制作的慢性腦缺血模型時間點對于認(rèn)知能力下降的影響，本研究選擇新舊物體識別實驗對記憶力進(jìn)行再測試。42 d-Model與42 d-Sham、56 d-Model與56 d-Sham之間進(jìn)行比較，可見與Sham組相比，42 d和56 d 2時間點的Model組N-F/N+F值均減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖1F)。

2.2 慢性腦缺血對大鼠情緒影響

在曠場試驗中，本研究根據(jù)直立次數(shù)、穿格次數(shù)、修飾次數(shù)及排便次數(shù)對大鼠情緒進(jìn)行評價，將42 d-Model組與Sham組及56 d-Model組與Sham組比較?？梢?2 d、56 d的Model組與相應(yīng)的Sham組相比，直立次數(shù)(圖2A)及穿格次數(shù)(圖2B)均具有明顯的升高(P＜0.05)，其中以42 d更為明顯。在修飾次數(shù)(圖2C)及排便次數(shù)(圖2D)比較中，Model組比Sham組有所增多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 大鼠BCCA法制作的慢性腦缺血模型42 d、56 d逃避潛伏期、游泳速度(cm/s)、目標(biāo)象限路徑百分比(%)、穿越平臺次數(shù)及探索時間分辨指數(shù)的變化Fig.1 Changes of escape latency，swimming speed(cm/s)，target quadrant occupancy(%)，platform crossing and N-F/N+F subject to chronic cerebral ischemia caused by BCCA 42nd and 56th day

2.3 慢性腦缺血對大鼠海馬組織形態(tài)影響

利用HE染色對海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的組織形態(tài)進(jìn)行觀察，在光學(xué)顯微鏡下，42 d、56 d Sham組未見明顯組織狀態(tài)改變，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量分布正常，排列緊密而有序，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，細(xì)胞核圓而大，染色淺而均勻，核仁清晰。與之相比較，相應(yīng)時間點的Model組無明顯區(qū)別(圖3)。

2.4 慢性腦缺血引起小膠質(zhì)細(xì)胞活化

應(yīng)用 Iba1免疫熒光染色對 42 d-Model、42 d-Sham、56 d-Model和56 d-Sham 4組進(jìn)行染色，紅色為小膠質(zhì)細(xì)胞，藍(lán)色為細(xì)胞核。分別選取海馬左右兩側(cè)及皮質(zhì)左右兩側(cè)作為視野觀察，可見各組均有小膠質(zhì)細(xì)胞陽性著色。但兩時間點Model組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)與相應(yīng)Sham組比較可見明顯差別，各組內(nèi)左右兩側(cè)差異不明顯。42 d、56 d Sham組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多，染色較深，胞體較小，突起較少，呈分支狀，細(xì)長;42 d、56 d Model組小膠質(zhì)細(xì)胞染色加深，胞體增大，突起增多、變短，呈“阿米巴樣”。海馬與皮質(zhì)改變相近(圖4)。

圖2 大鼠BCCA法制作的慢性腦缺血模型42 d、56 d情緒的變化Fig.2 Changes of emotion in rats with chronic cerebral ischemia caused by BCCA 42nd and 56th day

圖3 大鼠慢性腦缺血海馬CA1和CA3區(qū)腦組織HE染色Fig.3 Histological morphology of CA1 and CA3 in hippocampus of rats after chronic cerebral ischemia

圖4 大鼠慢性腦缺血Iba1免疫熒光染色Fig.4 Iba1 immunofluorescent staining of rats by chronic cerebral ischemia

3 討論

慢性腦缺血可導(dǎo)致認(rèn)知及情緒障礙［7］，動物實驗可將此模型近似復(fù)制［8］，使其機(jī)制研究在動物模型中得以實現(xiàn)。以往研究［9-11］認(rèn)為慢性腦缺血與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、膽堿能系統(tǒng)改變等具有明顯相關(guān)性，而小膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)元缺失及腦白質(zhì)損害是其中重要的病理過程［12-15］。

本實驗利用國際上應(yīng)用較多的BCCA模型復(fù)制慢性腦缺血過程。缺血3 d為急性期，3～7 d為亞急性期，2周后即可認(rèn)為是慢性期。故本實驗選取42 d、56 d作為慢性腦缺血的觀察時間點。Morris水迷宮在空間學(xué)習(xí)記憶能力評價中具有風(fēng)向標(biāo)意義，根據(jù)結(jié)果提示BCCA 42 d及56 d均可使大鼠出現(xiàn)明顯的認(rèn)知能力下降，與Cechetti等［16］的研究結(jié)果一致;新舊物體識別表現(xiàn)出趨勢，但是無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮該評價在小鼠實驗中應(yīng)用更為廣泛，對于大鼠測評具有一定局限性，尚需完善。既往研究［17］提示BCCA大鼠可出現(xiàn)焦慮抑郁等情緒障礙，與之相應(yīng)，曠場試驗中Model組的垂直次數(shù)及穿格次數(shù)均見明顯升高，提示BCCA大鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。進(jìn)而證明42 d及56 d均可將慢性腦缺血的行為學(xué)表現(xiàn)完全復(fù)制。

但海馬神經(jīng)元的HE染色結(jié)果變化不明顯，與既往研究一致，如Tian等［18］BCCA后60 d進(jìn)行染色提示與Sham組相比并無明顯的形態(tài)變化?？紤]與模型制作時間短而神經(jīng)元缺失不突出有關(guān)，也與HE染色針對性不強(qiáng)，對神經(jīng)元損傷不敏感有關(guān)，可進(jìn)一步采用尼氏染色等方法驗證。而Iba1的免疫熒光表現(xiàn)提示BCCA 42 d及56 d均出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化表現(xiàn)，印證BCCA與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。

因病理狀態(tài)及表現(xiàn)與發(fā)病時間相應(yīng)，故在慢性腦缺血研究中，出現(xiàn)4、8、12周及更長等不同的模型制作時間［19-21］。根據(jù)本實驗結(jié)果提示，BCCA 42 d即出現(xiàn)認(rèn)知、情緒及小膠質(zhì)細(xì)胞活化，56 d表現(xiàn)更加突出，但HE染色未見病理變化。學(xué)者可根據(jù)自己的研究方向選擇適宜的模型制作時間。

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