吳 媛 董凌月 安 威*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，北京100069;2.肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069)

肝臟作為人體重要的生命器官，具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能。肝臟具有超強(qiáng)的再生功能，肝部分切除或肝損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞數(shù)量減少均可啟動肝再生過程［1］。近來研究［2］表明，激素、生長因子和細(xì)胞因子等多種物質(zhì)參與肝再生的調(diào)節(jié)。肝刺激因子(hepatic stimulator substance，HSS)作為肝細(xì)胞源性活性因子可能在肝再生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。HSS最初是在20世紀(jì)80年代初從幼年動物肝臟或成年動物的再生肝臟中所提?。?-3］，能刺激部分肝切除后的大鼠肝臟再生［3］。隨后，HSS又在小鼠、兔、狗和人的肝臟中被發(fā)現(xiàn)［4］。HSS通過一種尚未闡明的機(jī)制作用于肝細(xì)胞，特異性刺激肝細(xì)胞及肝腫瘤細(xì)胞系增生，促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成，激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，減輕CCl4或氨基半乳糖對肝細(xì)胞的毒性損傷，逆轉(zhuǎn)肝纖維化［1，5-6］，而對其他組織類型的細(xì)胞無促進(jìn)作用［6-7］。鑒于HSS的來源和作用的組織特異性，對其功能的相關(guān)研究備受重視。目前發(fā)現(xiàn)HSS不僅是一種巰基氧化酶，可催化多種蛋白質(zhì)形成二硫鍵，而且還具備細(xì)胞色素c還原酶活性，能將電子傳遞到細(xì)胞色素c參與氧化磷酸化過程［8］。除此之外，HSS可以穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［9］。

上述研究表明HSS具有多樣的生物學(xué)功能。與HSS功能的研究相比，關(guān)于HSS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的研究則相對滯后，對其在不同生理病理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制更所知甚少。近年的研究［10-11］顯示c-Jun與肝核因子4(hepatic nuclear factor 4，HNF4)均可以結(jié)合到hHSS的5'側(cè)翼序列而下調(diào)hHSS的表達(dá)，同時(shí)在肝再生中起重要作用的表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)能通過JNK1激酶途徑，活化CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋 白 α (CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα)，促進(jìn)其與hHSS啟動子C/EBP2位點(diǎn)(-292/-279)結(jié)合，降低 hHSS的表達(dá)［12］。在 EGF對 HSS的表達(dá)調(diào)控研究中，發(fā)現(xiàn)除了 C/EBP2位點(diǎn)外，C/EBP1位點(diǎn)(-343/-330)也參與hHSS轉(zhuǎn)錄的負(fù)性調(diào)控，但C/EBPα并不能結(jié)合此位點(diǎn)發(fā)揮作用。C/EBP家族具有 C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、C/EBPγ、C/EBPε和C/EBPζ 6名成員，那是否存在其他成員與C/EBP1位點(diǎn)的結(jié)合呢?因此選擇了在肝臟中高表達(dá)，參與肝再生早期進(jìn)程的C/EBPα作為研究對象，探討其是否能通過C/EBP1位點(diǎn)抑制hHSS的表達(dá)，及是否參與EGF對hHSS的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞系(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存);高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco/BRL公司);胎牛血清(美國 Hyclone公司);LightShift?EMSA化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司);NE-PER?核蛋白質(zhì)提取試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司);Lipofectamine 2000脂質(zhì)體(美國Invitrogen公司);SYBR Green PCR Master Mix(美國ABI公司);化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Santa Cruz公司);M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司);RNeasy Mini Kit(德國Qiagen公司);BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(美國Pierce公司);C/EBPα單克隆抗體(美國Santa Cruz公司);C/EBPα磷酸化多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司);羊抗鼠IgG抗體-辣根過氧化物酶及羊抗兔IgG抗體-辣根過氧化物酶(北京中山公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗GAPDH抗體(中國康成公司)。

1.2 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞(人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系)生長在10%胎牛血清、含有青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的高糖DMEM培養(yǎng)液中。在無菌條件下，于95%的相對濕度、5%CO2、37℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24～48 h傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)

凝膠遷移或電泳遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是在體外研究蛋白質(zhì)和其相關(guān)的DNA序列相互作用的常用方法之一。人工合成3'生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針(含有候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))，由上海生工生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)合成。按1.4的方法提取HepG2細(xì)胞核蛋白質(zhì)，取15 μg核蛋白質(zhì)和生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，其余試劑來自于光化學(xué)EMSA試劑盒，室溫孵育30 min。競爭性實(shí)驗(yàn)中以100倍過量的未標(biāo)記生物素的探針作為競爭結(jié)合對照進(jìn)行特異性分析;用針對候選轉(zhuǎn)錄因子的抗體2 μL進(jìn)行超遷移分析。之后選用6%非變性聚丙烯胺凝膠進(jìn)行電泳分離，再以380 mA恒流轉(zhuǎn)印40 min，紫外交聯(lián)，化學(xué)發(fā)光法(化學(xué)發(fā)光核酸檢測試劑盒)檢測生物素標(biāo)記的DNA。

1.4 提取核蛋白質(zhì)

按照NE-PER?核蛋白質(zhì)提取試劑盒的操作方法進(jìn)行，具體步驟如下:用1×PBS懸浮 2×106個(gè)HepG2細(xì)胞，4℃以500 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min，小心充分地棄去上清;裂解細(xì)胞，加200 μL冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液CERⅠ，最大轉(zhuǎn)速渦旋15 s，置冰上10 min。重復(fù)此步驟3次;加11 μL冰預(yù)冷的CERⅡ，最大轉(zhuǎn)速渦旋5 s，置冰上1 min，重復(fù)1次;最大轉(zhuǎn)速渦旋5 s，4 ℃，16 000 r/min，離心 5 min，上清為漿蛋白質(zhì)，收集后分裝置-80℃保存;向沉淀中加入100 μL冰預(yù)冷的核提取液NER，重懸沉淀;最大轉(zhuǎn)速渦旋15 s，置冰上10 min.，反復(fù)5次;4℃，16 000 r/min，離心10 min。上清為核蛋白質(zhì)，留部分蛋白質(zhì)定量，其余分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 轉(zhuǎn)染 siRNA

C/EBPα siRNA的序列設(shè)計(jì)參考已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)［13］中提供的信息。BLAST搜索結(jié)果顯示這些RNA干涉序列與其他已知的人基因序列不具有同源性。此外采用一個(gè)與其他已知的哺乳動物基因序列不具有同源性的siRNA序列作為陰性對照。雙鏈小RNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。將已退火的siRNA溶解在150 μL無RNase的滅菌DEPC水中，使其終質(zhì)量濃度為20 μmol/L，分裝放入-80℃保存?zhèn)溆?。siRNA序列如下:

按LipofectamineTM2000說明書的操作方法將siRNA轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中:轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞以每毫升3×105個(gè)的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，于轉(zhuǎn)染當(dāng)日細(xì)胞達(dá)80%～90%的匯合率;用無血清無抗生素的opti-MEM培養(yǎng)液稀釋siRNA(600 pmol)至終體積250 μL;用無血清無抗生素opti-MEM培養(yǎng)液稀釋LipofectamineTM2000 10 μL 至終體積250 μL。室溫放置5 min;混合上述兩份培養(yǎng)基，室溫孵育30 min;棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，換用新鮮的無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基500 μL;將siRNA和轉(zhuǎn)染試劑混合物500 μL加到6孔培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)6 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含10%FBS的無抗生素的DMEM培養(yǎng)基2 mL;繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞分別提取蛋白質(zhì)和mRNA，用于real-time PCR實(shí)驗(yàn)。

1.6 EGF 處理

將細(xì)胞以每毫升3×105個(gè)的密度接種在多聚賴氨酸包被后的6孔培養(yǎng)板中并加入DMEM培養(yǎng)基，24 h后將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基孵育12 h，加入10 ng/mL的EGF繼續(xù)培養(yǎng)3 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

1)細(xì)胞總RNA的提取:按照 QIAGEN?RNeasy Mini Kit說明書的操作方法提取細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量濃度及純度。

2)反轉(zhuǎn)錄方法制備cDNA:將稀釋后的總RNA(2 μg)、Oligo(dT)15(0.5 μL)、10 mmol/L dNTP(1 μL)、超純水(6.5 μL)，依次加入 PCR 反應(yīng)管中，65℃反應(yīng)5 min，立即轉(zhuǎn)入冰浴中，短暫離心后，加入5 × 第一鏈緩沖液(4 μL)，0.1 mmol/L DTT(2 μL)、M-MLV(200 單位)(1 μL)、超純水(1 μL)，輕輕混勻，短暫離心，37℃，50 min;70℃，l5 min終止反應(yīng)，冰浴冷卻，并以不加反轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)體系作為陰性對照。

3)繪制引物標(biāo)準(zhǔn)曲線:根據(jù)cDNA序列，通過Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物。以某一個(gè)樣本的4個(gè)不同量的 cDNA 為模板(100 ng、50 ng、25 ng、10 ng)做實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(ABI 7300)，反應(yīng)條件:95℃，10 min后;95℃，15 s;60℃，1 min，共50個(gè)循環(huán)。將所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。將每個(gè)反應(yīng)的Ct值與其cDNA加入量(ng)的對數(shù)值進(jìn)行線性相關(guān)分析，計(jì)算其斜率，當(dāng)斜率在-3.6～-3.0范圍內(nèi)時(shí)，認(rèn)為該反應(yīng)的Ct值與相對應(yīng)的模板量呈對應(yīng)關(guān)系。故選取斜率位于-3.6～-3.0的引物序列待用。

4)樣本測定:使用選定的引物對樣本做real-time PCR反應(yīng)，將檢測的臨界點(diǎn)設(shè)定在PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)作為模板初始質(zhì)量濃度的間接指標(biāo)，熔解曲線分析采用默認(rèn)條件。結(jié)果用18S RNA進(jìn)行校正。用(Ct法計(jì)算相對基因表達(dá)，確定mRNA的相對質(zhì)量濃度。在實(shí)時(shí)定量分析中所得的熒光值可以反映目的產(chǎn)物的含量，各組所測得目的基因的Ct值與18S RNA的Ct值的差值為ΔCt。各實(shí)驗(yàn)組的ΔCt與對照組ΔCt值的差值為ΔΔCt。

1.8 Western blotting 檢測

在4℃條件下，加入裂解液提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，用BCA Protein Assay Kit測定樣品蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣本取50 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉4 h，加入按1∶5 000稀釋的抗體于4℃孵育過夜，TBST漂洗2次，每次5 min，加入用抗體稀釋液稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次5 min，將膜用化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min，于X線片上曝光，常規(guī)顯影、定影。洗膜后孵育GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參，將結(jié)果用Genetools軟件(PerklmElmer)進(jìn)行密度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS11.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用方差分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 C/EBPα參與hHSS的負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程

在本實(shí)驗(yàn)室以往研究中［12］顯示將位于hHSS啟動子-343至-330區(qū)域的C/EBP1位點(diǎn)突變后，hHSS啟動子活性明顯增強(qiáng)，但C/EBPα并不與此位點(diǎn)結(jié)合。因此需要確定是否有C/EBP家族其他成員與C/EBP1位點(diǎn)結(jié)合。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，提取HepG2核蛋白質(zhì)，合成含有C/EBP1位點(diǎn)的5'末端生物素標(biāo)記的探針，利用EMSA的方法分析轉(zhuǎn)錄因子與C/EBP1位點(diǎn)在體外是否存在相互作用。結(jié)果如圖1所示，HepG2細(xì)胞的核蛋白質(zhì)可以與C/EBP1探針(-351/-325)結(jié)合形成一條由DNA蛋白質(zhì)復(fù)合體組成的延遲帶(泳道2、3和5)，該條帶可以被100倍過量的未標(biāo)記C/EBP1探針競爭與核蛋白質(zhì)的結(jié)合而消失(泳道1)，但不能被C/EBP1位點(diǎn)突變的探針競爭消失(泳道4)。C/EBPα抗體的加入可以使延遲帶的上方出現(xiàn)超延遲帶(泳道7)，而正常兔血清(泳道8)的加入對延遲帶沒有影響。以上結(jié)果表明C/EBPα與C/EBP1位點(diǎn)在體外可以相互結(jié)合，提示C/EBPα可能參與hHSS的負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。

圖1 轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα與hHSS啟動子內(nèi)C/EBP1位點(diǎn)(-343～-330)在體外相互作用Fig.1 The results from EMSAs clearly demonstrate that C/EBP binds the C/EBP1 site(-343/-330)

2.2 C/EBPα抑制hHSS蛋白質(zhì)表達(dá)

為確定轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα對hHSS的表達(dá)是否具有抑制作用，應(yīng)用C/EBPα siRNA沉默其表達(dá)，檢測hHSS mRNA表達(dá)的變化。首先將C/EBPα siRNA和與人類任何基因均沒有同源的陰性對照siRNA分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)后進(jìn)行Western blotting檢測。圖2顯示C/EBPα siRNA轉(zhuǎn)染后可明顯降低內(nèi)源性C/EBPα的表達(dá)。

2.3 C/EBPα抑制hHSS mRNA表達(dá)

在證實(shí)了C/EBPα siRNA有效之后，再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，可見C/EBPα表達(dá)下調(diào)后可明顯增加hHSS mRNA的表達(dá)，與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA相比，表達(dá)上調(diào)了2.1倍(圖3)，這說明C/EBPα可以抑制hHSS的表達(dá)。

圖2 C/EBPα siRNA轉(zhuǎn)染后C/EBPα表達(dá)降低Fig.2 C/EBP expression is inhibited by C/EBP siRNA

圖3 C/EBPα表達(dá)沉默增強(qiáng)hHSS的表達(dá)Fig.3 C/EBP has a negative role in hHSS expression

2.4 C/EBPα表達(dá)下降不影響 EGF對 hHSS表達(dá)的抑制作用

沉默實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明了C/EBPα具有與以往研究［12］中 C/EBPα 及 EGF類似的作用，即可以下調(diào)hHSS的表達(dá)，那么C/EBPα在EGF下調(diào)hHSS表達(dá)的過程中起著怎樣的作用呢?為此本課題組將C/EBPα siRNA和陰性對照siRNA分別轉(zhuǎn)染至hepG2細(xì)胞中，48 h后進(jìn)行EGF刺激，結(jié)果顯示 C/EBPα表達(dá)下降后，沒有影響EGF對hHSS表達(dá)的抑制作用(圖4)。

2.5 EGF不改變C/EBPα的活性和表達(dá)

為了進(jìn)一步證實(shí)C/EBPα雖然可以抑制hHSS的表達(dá)，但是不參與EGF對hHSS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，檢測EGF處理后C/EBPα的磷酸化及表達(dá)的變化。將細(xì)胞用EGF(終質(zhì)量濃度為10 ng/mL)處理后提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，應(yīng)用C/EBPα總抗體和 C/EBPα Thr222/Thr226-磷酸化抗體，通過Western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示，EGF既沒有改變C/EBPα的內(nèi)源性表達(dá)，也沒有影響C/EBPα的磷酸化(圖5)，說明EGF沒有改變C/EBPα的活性和表達(dá)，C/EBPα對EGF抑制hHSS的表達(dá)沒有作用。

圖4 C/EBPα表達(dá)沉默對EGF抑制hHSS表達(dá)的影響Fig.4 Down-regulation of C/EBP expression did not affect EGF inhibition of hHSS mRNA expression

圖5 Western blotting檢測EGF對C/EBPα的影響Fig.5 C/EBP does not participate in EGF inhibition of hHSS mRNA by Western blotting

3 討論

C/EBPα在肝臟中表達(dá)豐富，參與調(diào)節(jié)肝臟多種生物學(xué)進(jìn)程，例如能量代謝、解毒、急性期反應(yīng)、細(xì)胞色素Pα基因表達(dá)、肝臟腫瘤發(fā)生等。與C/EBPβ功能不同的是，C/EBPα是一種細(xì)胞增生的抑制劑，具有很強(qiáng)的抑制增生促進(jìn)分化的功能［14-15］。本課題組將C/EBPα siRNA轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞后，觀察到hHSS表達(dá)的下降，同時(shí)EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)C/EBPα可以與hHSS啟動子的C/EBP順式作用元件(C/EBP1，-343/-330)結(jié)合，說明C/EBPα對hHSS表達(dá)具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)室室研究顯示(研究數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，隨著肝細(xì)胞的成熟，HSS的表達(dá)逐漸降低(未發(fā)表數(shù)據(jù))，而C/EBPα則與此相反，在終末分化的成熟肝細(xì)胞中表達(dá)最高。兩者表達(dá)的相反變化，與本研究發(fā)現(xiàn)的C/EBPα抑制hHSS表達(dá)這一現(xiàn)象相一致，意味著在肝細(xì)胞成熟分化過程中HSS的表達(dá)變化可能與C/EBPα相關(guān)。

雖然C/EBPα對于hHSS的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用與既往研究［14］發(fā)現(xiàn)的 C/EBPα相似，即抑制 hHSS的表達(dá)，但兩者與hHSS啟動子結(jié)合的位置不同，而且多個(gè)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)C/EBPα不同于C/EBPβ并不參與EGF對hHSS表達(dá)的下調(diào)作用，這意味著兩者可能在不同的生理病理過程中分別對hHSS行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，抑制hHSS的表達(dá)。有研究［16］表明，肝大部分切除術(shù)后C/EBPα表達(dá)快速增加，而C/EBPα則正好相反，其活性急速降低。這時(shí)HSS蛋白質(zhì)的下降可能與 C/EBPβ而非C/EBPα的調(diào)控相關(guān)，兩者在不同的細(xì)胞生命活動中調(diào)控轉(zhuǎn)換的具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究?？傊?，C/EBPα可通過C/EBP結(jié)合位點(diǎn)抑制hHSS的表達(dá)。

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