陳予東 楊巍巍 李 昕 王 鵬 李旭冉 于 順

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室北京市老年病醫(yī)療研究中心分子診斷實驗室教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京100053)

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是一種由 144個氨基酸構(gòu)成的酸性可溶性蛋白，主要存在于神經(jīng)元突觸前末梢［1］。α-Syn與神經(jīng)退行性病變密切相關(guān)，在帕金森病(Parkinson's disease，PD)患者、路易體癡呆(dementia with Lewy bodies，DLB)患者腦組織的路易體中(Lewy body，LB)［2-4］，肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者細(xì)胞內(nèi)包涵體中［5-7］均能檢測到α-Syn存在。但是α-Syn如何參與這些神經(jīng)退行性病變的病理生理過程目前尚不明確。

α-Syn可分泌到細(xì)胞外［8］，而胞外 α-Syn可通過內(nèi)吞相關(guān)蛋白-Rab5B［9］的介導(dǎo)快速進入細(xì)胞。鑒于Rab5B也參與N-甲基D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體的內(nèi)在化，且文獻［10-11］表明 α-Syn在多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中促進NMDA受體內(nèi)在化，因此本研究目的是在原代神經(jīng)元及轉(zhuǎn)基因動物水平上，觀察α-Syn對NMDA受體的影響及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 材料

健康C57/B6新生鼠，鼠齡0～12 h，野生型C57/B6鼠，18～22 g，由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供(實驗動物許可證號:SCXK-2014-004)。轉(zhuǎn)α-Syn C57/B6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供(實驗動物許可證號:SYXK:2014-0039)。杜恩斯組織勻漿器 (Wheaton Kimble公司，美國)。NMDA(Sigma公司，美國)，Neurobasal培養(yǎng)基 (Gibco公司，美國)，B27(Gibco公司，美國)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，胎牛血清(FCS)(Berlin公司，美國)，NMDAR NR1抗體 (Abcam 公司，英國)，DAPI(Sigma公司，美國)，Rab5B抗體 (Santa Cruz公司，美國)，Rab5B反義寡核苷酸 (百維恩公司，中國)，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Pierce Biotech公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 重組人α-Syn的制備

將人α-Syn cDNA插入表達(dá)載體pET。然后將pET-α-Syn轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐西林的2%YTA培養(yǎng)液中培養(yǎng)，加IPTG誘導(dǎo)基因重組蛋白表達(dá)。所表達(dá)的基因重組型α-Syn采用離子交換層析和反向?qū)游龇兓CA法定量純化后的α-Syn。

1.2.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

冰上斷頭取出C57/B6新生鼠雙側(cè)海馬，剪碎后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，用DMEM培養(yǎng)基(90%DMEM+10%胎牛血清)終止消化。玻璃滴管火焰拋光后，輕柔吹打。用DMEM培養(yǎng)基稀釋成5×105/mm3的密度接種到直徑35 mm多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。2 h后，顯微鏡下觀察神經(jīng)元貼壁后，改用Neurobasal、B27無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以后每3 d換液一次，培養(yǎng)10～12 d左右用于實驗。

1.2.3 Rab5B反義寡核苷酸

Rab5B反義寡核苷酸(antisense sequence，AS)及擾亂順序的寡核苷酸(scrambled sequence，SS)包被的慢病毒且攜帶GFP蛋白由中國百維恩公司采購，其序列分別為:5'-GCTGTGCTTCTGCTAGTCAT-3'和 5'-GGGTTCGTTTCTC-TCAGTCA-3'。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測

按照實驗分組，向海馬神經(jīng)元培養(yǎng)基中添加攜帶GFP-AS及GFP-SS的慢病毒，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，部分神經(jīng)元培養(yǎng)基中添加α-Syn(10 μmol/L)，37℃孵育1 h。細(xì)胞用PBS輕輕漂洗后，用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，1%BSA封閉1 h。將細(xì)胞與抗NMDAR NR1單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、抗Rab5B單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，于4℃反應(yīng)過夜，然后與FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)反應(yīng)2 h。熒光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.5 蛋白提取物的制備

1)腦勻漿蛋白提取:將野生型及轉(zhuǎn)α-Syn C57/B6小鼠處死后，剝離雙側(cè)海馬體至杜恩斯組織勻漿器，加入適量蛋白裂解液(總蛋白裂解液或膜蛋白裂解液)勻漿，全程均在冰上操作。將腦組織勻漿15 000 g，1 h，4℃離心，上清即為總蛋白或膜蛋白，BCA法定量。

2)細(xì)胞蛋白提取:培養(yǎng)10～12 d的海馬神經(jīng)元用預(yù)冷的PBS洗2遍后加入蛋白裂解液(總蛋白裂解液或膜蛋白裂解液)，15 000 g，1 h，4℃離心，上清即為總蛋白或膜蛋白，BCA法定量。

1.2.6 Western blotting分析

7.5 %及12.5%的SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF膜。PVDF膜與NMDAR NR1單克隆抗體(1∶1 000)，Rab5B抗體(1∶1 000)于4℃反應(yīng)過夜，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫反應(yīng)1 h，ECL試劑盒檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-Syn促進原代海馬神經(jīng)元膜蛋白NMDAR1內(nèi)在化

免疫熒光技術(shù)觀察原代海馬神經(jīng)元胞膜的NMDAR NR1分布表達(dá)狀況。如圖1所示，正常培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中多數(shù)NMDAR NR1定位于細(xì)胞膜，少量位于細(xì)胞質(zhì)。而 α-Syn預(yù)處理后，神經(jīng)元多數(shù)NMDAR NR1定位于細(xì)胞質(zhì)，發(fā)生內(nèi)在化。

圖1 α-Syn對原代神經(jīng)元細(xì)胞表面NMDAR NR1的影響Fig.1 Effect of α-Syn on cell surface NMDAR NR1 expression in primary neurons

2.2 轉(zhuǎn)α-Syn基因小鼠海馬神經(jīng)元中NMDAR NR1內(nèi)在化增多

抽提野生型與轉(zhuǎn)α-Syn C57/B6小鼠海馬細(xì)胞質(zhì)及全細(xì)胞蛋白行Western blotting分析，結(jié)果如圖2A所示，轉(zhuǎn)基因小鼠全細(xì)胞中含有較高的α-Syn水平。如圖2B所示，轉(zhuǎn)α-Syn C57/B6小鼠膜蛋白組分中NMDAR NR1較野生型小鼠降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而全細(xì)胞蛋白組分中2組小鼠NMDAR NR1并無顯著變化。圖2C結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)α-Syn C57/B6小鼠中Rab5B蛋白表達(dá)較野生型小鼠顯著增高，且二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 Rab5B蛋白參與 α-Syn促進NMDAR NR1的內(nèi)在化

如圖3所示，外加α-Syn可促進NMDAR NR1下膜，而應(yīng)用Rab5B反義核苷酸處理原代海馬神經(jīng)元后，可消除α-Syn促進NMDAR NR1內(nèi)在化的作用。

圖2 轉(zhuǎn)α-Syn基因小鼠海馬神經(jīng)元中NMDAR NR1內(nèi)在化增多Fig.2 Increased NMDAR NR1 internalization in hippocampal neurons of α-Syn transgenic mice

圖3 抑制Rab5b表達(dá)對α-Syn引起的細(xì)胞表面NR1下調(diào)作用的影響Fig.3 Effects of Rab5b suppression on α-Syn-induced surface NR1 reduction

3 討論

筆者發(fā)現(xiàn)在原代神經(jīng)元及轉(zhuǎn)基因動物水平，α-Syn仍然使神經(jīng)細(xì)胞表面NR1表達(dá)減少，但不改變總的NR1表達(dá)量。NR1是NMDA受體的重要亞單位，其數(shù)量減少提示NMDA受體數(shù)量的減少。α-Syn減少細(xì)胞表面NR1而不改變總NR1表達(dá)量提示，α-Syn很可能通過引起NMDA受體內(nèi)在化而下調(diào)細(xì)胞表面NMDA 受體含量［11］。

NMDA受體的內(nèi)在化是通過內(nèi)吞機制實現(xiàn)的［12］。有證據(jù)［13］表明，NMDA 受體的內(nèi)吞受 Rab5B介導(dǎo)，因此推測，Rab5B可能參與了 α-Syn引起的NMDA受體內(nèi)吞。為了證明Rab5B在α-Syn介導(dǎo)的NMDA受體內(nèi)在化中起作用，本研究觀察了α-Syn對Rab5B表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞及動物水平，α-Syn均可上調(diào)Rab5B，并且其小干擾RNA可阻斷α-Syn對NMDA受體的作用。以上結(jié)果均表明α-Syn是通過調(diào)節(jié)內(nèi)在化相關(guān)蛋白Rab5B促進NMDA受體內(nèi)在化。

NMDA受體廣泛參與神經(jīng)退行性疾病患者的興奮性神經(jīng)元損傷并引起其認(rèn)知功能障礙。α-Syn對NMDA受體內(nèi)在化的調(diào)控對揭示上述患者興奮性神經(jīng)元損傷并導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙起重要作用。

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