湯 然 王旖旎 張 嘉 李 碩 王 昭

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院血液內(nèi)科，北京100050)

噬血細(xì)胞綜合征(hemophagocytic syndromes，HPS)，是一組因遺傳性或獲得性免疫功能異常導(dǎo)致的以過度炎性反應(yīng)為基本特征的臨床綜合征。主要由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和吞噬細(xì)胞系統(tǒng)異常激活、增生，分泌大量炎性細(xì)胞因子，引起的一系列炎性反應(yīng)［1］。在HPS的各種臨床特點(diǎn)中，發(fā)熱及血細(xì)胞減少最為常見。在介導(dǎo)血細(xì)胞減少的機(jī)制中，炎性反應(yīng)因子，尤其是γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)可能是影響骨髓造血的重要因素。因此，有必要深入了解IFN-γ對骨髓的影響情況及集落刺激因子對抗因IFN-γ使骨髓出現(xiàn)的抑制作用情況。為進(jìn)一步提高對該病的認(rèn)識，選擇及時(shí)有效的治療方案及改善疾病預(yù)后提供臨床依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1)標(biāo)本來源:患者骨髓取自16例經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查確診的HPS患者;正常對照組骨髓取自11例移植供者。上述兩組取樣前均未系統(tǒng)使用過免疫抑制劑、維甲酸類及影響造血功能的化療藥物。

2)實(shí)驗(yàn)試劑:淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，相對密度1.077)，RPMI-1640培養(yǎng)液，胎牛血清(Hyclone公司)，培養(yǎng)采用人造血干細(xì)胞甲基纖維素培養(yǎng)基(德國Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品，StemMACS HSC-CFU，含1%甲基纖維素、IMDM、L-Glutamine(2 mmol/L)、Methylcellulose(1%)、FBS(30%)、BSA(1%)、β-mercaptoethanol(10-4mol/L)。CD34+抗體(德國美天旎公司)。干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)和白介素-3(interleukin-3，IL-3)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)、促粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)均為德國美天旎公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1)人骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear，MNCs)的制備:獲取的骨髓常規(guī)用相對密度為1.077g/mL的淋巴細(xì)胞分離液，應(yīng)用密度梯度離心法獲得HPS患者及正常人MNCs，1 500r/min離心10 min，棄去上清，加入1 mL含15%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)MNC數(shù)。

2)CD34陽性細(xì)胞的標(biāo)記:按照磁珠試劑分離說明要求，將分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞按每1×107細(xì)胞加入懸浮于80 μL 4℃ buffer中，加入20 μL混勻的CD34+免疫磁珠進(jìn)行配比，充分混勻，使磁珠與CD34+細(xì)胞充分結(jié)合，4℃冷藏30 min。

3)免疫磁珠法分選CD34陽性細(xì)胞:將標(biāo)記好的MNCs，加入孵育體積10 ～20 倍 buffer，1 500 r/min 離心10 min，離心后充分吸除上清，加入500 μL buffer重懸細(xì)胞。準(zhǔn)備好MS分離柱，置于Mini MACS磁力架上用500 μL buffer潤柱。向MS柱中注入細(xì)胞懸液，結(jié)合CD34陽性細(xì)胞的磁珠吸附于磁力架中，收集CD34陰性成分。用500 μL的緩沖液沖洗柱子共3次。將柱子移開磁場到一合適的容器中，用1 mL緩沖液稍用力沖洗。收集CD34陽性細(xì)胞。

4)骨髓造血干、祖細(xì)胞集落的培養(yǎng):采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系培養(yǎng)CD34+細(xì)胞，檢測集落形成能力。培養(yǎng)體系含1%甲基纖維素、IMDM、L-Glutamine(2 mmol/L)、Methylcellulose(1%)、FBS(30%)、BSA(1%)、β-mercaptoethanol(10-4mol/L)、SCF、IL-3、G-CSF、GM-CSF、EPO 和 CD34+細(xì)胞(5 ×103/mL)。在35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(每孔1.1 mL，復(fù)種1皿)，37C，5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)14 d，分別計(jì)數(shù)粒-巨噬細(xì)胞集落生成單位(colony forming units-granulocyte macrophage，CFU-GM)、爆式紅系集落生成單位(burst forming unit-erythroid，BFU-E)、紅系集落生成單位(colony forming units，CFU-E)、混合系集落生成單位(colony forming units-granulocyte erythroid macrophage megakaryocyte，CFU-GEMM)，其總數(shù)為集落形成細(xì)胞(colony forming cell，CFC)數(shù)。

5)體外實(shí)驗(yàn)IFN-γ對血細(xì)胞減少的影響:在上述培養(yǎng)體系中加入不同濃度的 IFN-γ，分別為0.1、1、10、100 ng/mL，14 d后觀察集落生長情況，并設(shè)未添加IFN-γ組為對照組，觀察不同濃度梯度IFN-γ對骨髓細(xì)胞定向分化的影響。

6)對照組:從上述實(shí)驗(yàn)組篩選出能夠使骨髓細(xì)胞分化發(fā)生改變的最低IFN-γ濃度組，以原體系的2倍、5倍、10倍提高G-CSF、GM-CSF及EPO的濃度，并設(shè)不提高細(xì)胞因子組為對照組，14 d后觀察集落生長情況，觀察提高細(xì)胞生長因子的濃度是否能夠克服IFN-γ對骨髓細(xì)胞定向分化的干擾，以及相應(yīng)的濃度比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)中所涉及的數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，對其分布進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，不服從正態(tài)性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)應(yīng)用中位數(shù)(四分位數(shù))表示。在兩兩比較分析中，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)的資料采用秩和檢驗(yàn)。組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長狀況的觀察

2.1.1 骨髓造血干、祖細(xì)胞的生長狀況

培養(yǎng)即刻觀察，細(xì)胞基本分布均勻;培養(yǎng)3 d時(shí)，細(xì)胞增多，有形成集簇的傾向，以粒單系為主(圖1A);培養(yǎng)7 d可見集落增多(圖1B)，各集簇細(xì)胞數(shù)目增多;培養(yǎng)14 d時(shí)肉眼可見集落形成，集落中心致密，邊緣較松散，可見 CFU-GM、BFU-E、CFU-E、CFUGEMM(圖1C)。CFU-GM:細(xì)胞集落扁平，集落中可含有大小2種類型的細(xì)胞，粒細(xì)胞較小，單核細(xì)胞相對較大;BFU-E:細(xì)胞由于含有血紅蛋白，顏色可為紅色、橙紅色或褐色集落，大約含有＞200個(gè)早期紅系祖細(xì)胞，越是成熟，顏色越明顯(圖1D);CFU-E:細(xì)胞由于含有血紅蛋白，顏色可為紅色、橙紅色或褐色，集落大約含有8～200個(gè)紅系祖細(xì)胞(圖1E)。CFUGEMM類似“煎蛋”的集落形態(tài)，具有一個(gè)緊湊的中心區(qū)域以及透明細(xì)胞組成的外周扁平區(qū)，含有血紅蛋白的細(xì)胞呈紅色、橙紅色或褐色，位于集落外周的細(xì)胞有大有小，透明發(fā)亮，細(xì)胞數(shù)目是所有集落類型中最多的(圖1F);培養(yǎng)21 d時(shí)集落細(xì)胞數(shù)目增多，但細(xì)胞生長狀況呈下滑趨勢。

2.1.2 應(yīng)用瑞士染色鑒定集落組成

在顯微鏡下用毛細(xì)吸管吸取目標(biāo)集落，經(jīng)瑞氏染色后顯微鏡下可見幼稚紅細(xì)胞(圖2)。

HPS骨髓與正常人骨髓CD34+細(xì)胞在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后集落總數(shù)目未見差異(130.87 vs 122.67，P=0.493)，各系集落中集落數(shù)目及集落總數(shù)詳見表1。

圖1 不同天數(shù)的集落培養(yǎng)情況Fig.1 CFU colony in different days(40 × )

圖2 鏡下可見幼稚紅細(xì)胞Fig.2 Immature red blood cells can be seen

表1 不同組間CFU-GM、BFU-E、CFU-E、CFU-GEMM集落數(shù)比較Tab.1 Comparison of the number of CFU-GM，BFU-E，CFU-E，CFU-GEMM of different groups

2.2 IFN-γ對血細(xì)胞減少的影響

高倍鏡下，培養(yǎng)第3天時(shí)，對照組細(xì)胞形態(tài)飽滿、透明度高、折光性強(qiáng)，鮮見毛刺狀突起，而不同濃度梯度IFN-γ培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞可見毛刺狀突起，于IFN-γ濃度1 ng/mL起毛刺狀突起逐漸增多，形似蝌蚪狀，部分細(xì)胞可見固縮、凋亡(圖3)。

圖3 培養(yǎng)3 d后，不同濃度IFN-γ下集落生長情況Fig.3 The growth of colonies in different concentration gradient of IFN-γ at day 3

培養(yǎng)14 d后觀察各組細(xì)胞，對照組、0.1 ng/mL組集落大小與形態(tài)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、1 ng/mL組大部分集落大小、形態(tài)與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10 ng/mL組有些集落與對照組相比偏小，100 ng/mL組集落與對照組相比明顯偏小(圖4)。

圖4 培養(yǎng)14 d后，不同濃度IFN-γ下集落生長情況Fig.4 The growth of colony in different concentration gradient of IFN-γ 14 days later(40 ×)

當(dāng)IFN-γ濃度為0.1 ng/mL時(shí)，集落總數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(111.83 vs 110.83，P=0.968)各系集落均無差異;當(dāng)IFN-γ濃度提高到1 ng/mL，集落總數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(111.83 vs 86.00，P=0.281)，但骨髓細(xì)胞的分化已經(jīng)開始出現(xiàn)影響，CFU-GEMM(8.83 vs 4.17，P=0.004)已經(jīng)出現(xiàn)明顯差異;當(dāng)IFN-γ濃度提高到10 ng/mL時(shí)，集落總數(shù)目差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(111.83 vs 51.50，P=0.024)，除CFU-GM外，IFN-γ10 ng/mL組各集落與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中 CFU-GEMM差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)IFN-γ濃度提高到100 ng/mL時(shí)，集落總數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(111.83 vs 20.50，P=0.005)，IFN-γ100 ng/mL組CFU-GM集落數(shù)目與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各集落與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)IFN-γ濃度提升到10 ng/mL時(shí)為體外培養(yǎng)中影響血細(xì)胞生長的節(jié)點(diǎn)，所以在提升集落刺激因子的實(shí)驗(yàn)中，選取IFN-γ濃度10 ng/mL為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。不同濃度IFN-γ組集落數(shù)差異比較采用秩和檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，結(jié)果表明在不同濃度IFN-γ下，集落數(shù)存在差異，詳見表2。

2.3 提高細(xì)胞因子濃度后，IFN對骨髓細(xì)胞定向分化的影響

當(dāng)集落刺激因子提高到2倍濃度時(shí)，集落總數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(59.60 vs 101.00，P=0.014，圖5)，各集落中 BFU-E差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(15.54 vs 25.33，P=0.008)，其余集落差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)集落刺激因子提高到5倍濃度時(shí)，集落總數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(59.60 vs 127.00，P=0.001)，各集落差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中CFU-GM、BFU-E差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)集落刺激因子提高到10倍濃度時(shí)，集落總數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(59.60 vs 133.67，P=0.001)，各集落差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中CFU-GM、BFU-E差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度集落刺激因子集落數(shù)差異比較采用秩和檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，結(jié)果表明在不同濃度集落刺激因子條件下，集落數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。依據(jù)上述結(jié)果可以看出，在IFN-γ濃度為10 ng/mL時(shí)，以原體系的2倍、5倍、10倍提高 G-CSF、GM-CSF及EPO的濃度，骨髓生長情況均較原體系好轉(zhuǎn)(表3)。

表2 不同濃度IFN-γ組集落數(shù)差異比較Tab.2 Comparison of the number of colony in different IFN-γ groups (n=6)

表3 不同濃度集落刺激因子組集落數(shù)差異比較Tab.3 Comparison of the number of colony in different colony stimulating factor groups (n=6)

圖5 不同濃度集落刺激因子組集落差異比較Fig.5 Comparison of the colony of different colony stimulating factor groups(40×)

3 討論

在HPS的各種臨床特點(diǎn)中，發(fā)熱及血細(xì)胞減少最為常見，幾乎見于所有患者，其中外周血兩系及以上血細(xì)胞減少占97.2%，全血細(xì)胞減少者占31.9%［2-3］。而2013年美國血液學(xué)年會(American Society of Hematology，ASH)更是指出HPS典型癥狀為持續(xù)高熱、肝脾腫大、血細(xì)胞減少三聯(lián)征。各種成分的血細(xì)胞減少使患者易于發(fā)生感染、出血以及供血和血液攜氧功能障礙直接導(dǎo)致患者死亡，并且持續(xù)難以糾正的血細(xì)胞減少以及因此而產(chǎn)生的各種合并癥進(jìn)一步加重各臟器功能的損害，使患者無法耐受藥物治療的毒性，喪失治療機(jī)會。有研究［4］報(bào)道在敗血癥等感染性疾病中，無法解釋的持續(xù)性血細(xì)胞減少與不良預(yù)后密切相關(guān)。全血細(xì)胞減少的基本成因主要有兩大方面，一是骨髓生成障礙，二是外周消耗過多。全血細(xì)胞減少被認(rèn)為是由高濃度的IFN-γ和TNF-α以及噬血現(xiàn)象造成的，噬血現(xiàn)象可以直接導(dǎo)致血細(xì)胞被吞噬減少，而IFN-γ介導(dǎo)血細(xì)胞減少的機(jī)制是什么，其通過何種途徑介導(dǎo)血細(xì)胞減少尚不明確。造血干細(xì)胞是各種血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的起始細(xì)胞，具有自我復(fù)制和多向分化增生的能力［5-6］。在相應(yīng)的集落刺激因子的刺激下可以分化為不同的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)加入IFN-γ的實(shí)驗(yàn)組中，早期即可見到部分骨髓細(xì)胞呈毛刺狀突起，并有固縮、凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡首先是細(xì)胞縮小，胞質(zhì)凝縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松并和胞膜融合，核糖體、線粒體等聚集，但結(jié)構(gòu)無明顯改變。染色質(zhì)逐漸凝集成新月狀，附在核膜周邊，嗜堿性增強(qiáng)。之后細(xì)胞核固縮成均一的致密物，進(jìn)而核碎裂，胞膜完整。繼之核膜出芽，固縮染色質(zhì)脫落，形成膜包凋亡小體。最終凋亡小體被周圍吞噬細(xì)胞吞噬降解［7］。本實(shí)驗(yàn)中加入干擾素培養(yǎng)第3天時(shí)，對照組細(xì)胞形態(tài)飽滿、透明度高、折光性強(qiáng)，鮮見毛刺狀突起，而不同濃度梯度IFN-γ培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞可見毛刺狀突起，于IFN-γ濃度1 ng/mL起毛刺狀突起逐漸增多，形似蝌蚪狀，可疑為細(xì)胞凋亡過程中的膜出芽階段。IFN-γ是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。已有研究［8-10］證明，在動(dòng)物及人體內(nèi)可以通過誘導(dǎo)CD34陽性細(xì)胞Fas的表達(dá)及促進(jìn)半胱天冬酶1、3、8的上調(diào)和活化，促進(jìn)造血干祖細(xì)胞的凋亡，引起全血細(xì)胞減少。IFN-γ可以上調(diào)細(xì)胞表面CD95數(shù)目，增強(qiáng)Fas/FasL凋亡途徑，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。體外實(shí)驗(yàn)［11］也已證實(shí)，外源性IFN-γ對髓系、紅系、巨核細(xì)胞系等多能集落形成有直接抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中不同濃度的IFN-γ實(shí)驗(yàn)組，骨髓生長狀態(tài)有著不同的表現(xiàn)，當(dāng)IFN-γ濃度在0.1 ng/mL時(shí)，骨髓的增生、分化基本不受影響，培養(yǎng)14 d后各系集落數(shù)目以及集落數(shù)目總和與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯微鏡下觀察集落形態(tài)與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，集落致密。當(dāng)IFN-γ濃度提高到1 ng/mL時(shí)，雖然粒系、紅系以及集落數(shù)目總和較對照組沒有明顯變化，但鏡下可見一部分集落形態(tài)偏小。當(dāng)IFN-γ濃度逐漸升高后，小集落所占比例也相應(yīng)增高。當(dāng)IFN-γ濃度增加至100 ng/mL時(shí)，可見骨髓生長受到明顯抑制。證實(shí)了干擾素在骨髓抑制中起到了重要的作用。

體外半固體細(xì)胞培養(yǎng)集落形成單位是評價(jià)造血前體細(xì)胞增生分化能力的重要指標(biāo)，在適宜的集落刺激因子誘導(dǎo)下，不同的定向祖細(xì)胞可產(chǎn)生相應(yīng)的集落，如 CFU-GM、BFU-E、CFU-E、CFU-GEMM 等。集落刺激因子通?？梢杂糜诨熀蠊撬枰种疲蚣膊『笤煅蜃尤狈υ斐傻难?xì)胞減少［12］。本實(shí)驗(yàn)中提高集落刺激因子濃度后集落數(shù)目有明顯增長，證明對IFN-γ的骨髓抑制作用有一定的改善作用。目前集落刺激因子在HPS患者中的應(yīng)用尚存爭議。有研究［13］表明在HPS治療早期，聯(lián)合使用血小板生成素(thrombopoietin，TPO)可以提高血小板計(jì)數(shù)水平、縮短血小板減少的持續(xù)時(shí)間，促進(jìn)血小板恢復(fù)正常范圍，減少輸血次數(shù)和嚴(yán)重出血事件發(fā)生，并且對HPS治療無任何負(fù)面影響。

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