李懷斌，吳 鋒，龔 鑫，熊克仁

(皖南醫(yī)學院 人體解剖學教研室，安徽 蕪湖 241002)

揚子鱷是我國特有的珍稀動物，被列為國家一級重點保護野生動物，2000年世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄中將其列為極危級(CR)，成為全球23種鱷中最瀕危的鱷類［1］。揚子鱷在進化過程中處于由水生到陸生的關(guān)鍵過渡階段，近年來，人工繁殖的揚子鱷數(shù)量不斷增多，但野生揚子鱷野外生存數(shù)量仍在急劇減少，依然處于瀕危狀態(tài)，形勢十分嚴峻［2］。因此，從各方面、各層次加強開展對揚子鱷的科學研究，顯得尤為重要。我室曾采用還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶(NADPH-d)法對揚子鱷端腦、中腦的一氧化氮合酶(NOS)陽性神經(jīng)元進行了觀察研究［3－4］。有研究表明大鼠延髓有NOS陽性神經(jīng)元的分布，延髓是呼吸中樞所在，無論是在常氧還是在缺氧條件下，延髓產(chǎn)生的一氧化氮(NO)在節(jié)律性呼吸活動中的調(diào)節(jié)都具有重要作用［5－6］。NOS 可 分 為 誘 導 型 (iNOS)、內(nèi) 皮 型(eNOS)和神經(jīng)元型(nNOS)三種亞型，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最多的是nNOS亞型［7］。本項目采用免疫組織化學染色方法結(jié)合計算機圖像分析對揚子鱷與大鼠延髓內(nèi)nNOS陽性神經(jīng)元的分布和形態(tài)特征進行比較，找出二者間的分布規(guī)律和形態(tài)區(qū)別，以期為生物進化及揚子鱷種群遺傳保護方面的深入研究提供形態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 揚子鱷6只，體質(zhì)量(30±5)kg，雌雄不拘;SD大鼠15只，體質(zhì)量(200±20)g，雌雄不拘。

1.2 實驗方法 受揚子鱷腦取材限制，兩種動物再各分三次進行分次實驗，每次揚子鱷2只，SD大鼠5只。各組動物在同一時間內(nèi)，電擊處死后，迅速取出延髓，固定于4%甲醛固定液中，固定后梯度脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋。每組每只動物延髓的相同節(jié)段分別取連續(xù)切片5張(片厚5 μm)。常規(guī)脫蠟、脫水，微波熱修復，滴加兔抗多克隆nNOS抗體(稀釋比例為1∶100)，采用SABC法進行染色，DAB顯色后常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.3 結(jié)果觀察 在10×10倍視野下對nNOS陽性細胞的分布部位進行觀察;利用黑馬病理圖像分析系統(tǒng)對每張切片內(nèi)、外側(cè)部在10×40倍視野下進行nNOS陽性細胞計數(shù)，細胞形態(tài)分類統(tǒng)計，細胞大小測定(胞體最大徑)和平均灰度值測定。根據(jù)參考文獻［8］將陽性細胞分為大、中、小三類:小型細胞(胞體最大徑﹤10 μm)，中型細胞(胞體最大徑介于10～20 μm之間)，大型細胞(胞體最大徑﹥20 μm)。

2 結(jié)果

2.1 揚子鱷、大鼠延髓nNOS陽性神經(jīng)元的分布情況 以下部位觀察到nNOS陽性神經(jīng)元:揚子鱷延髓的中央管周圍灰質(zhì)、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)核團等部位;大鼠延髓的中央網(wǎng)狀核、外側(cè)網(wǎng)狀核、三叉神經(jīng)脊束核、下橄欖核、孤束核、疑核、副神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核等部位，所觀察到的nNOS免疫陽性神經(jīng)元成團塊狀或散在分布。見圖1。

圖1 揚子鱷、大鼠延髓nNOS陽性神經(jīng)元(免疫組化染色，×100)Fig 1 nNOS positive neurons in the medullar oblongata for the rats and A.sinensis(IHC，×100)

2.2 揚子鱷、大鼠延髓nNOS陽性神經(jīng)元分布的主要特征 大鼠比揚子鱷nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量增多(P＜0.05)，陽性細胞染色均呈現(xiàn)棕黃色，主要為胞膜與胞漿染色，胞核較大呈淡染，大鼠比揚子鱷陽性細胞著色加深，細胞灰度值變小(P＜0.05)。揚子鱷、大鼠延髓的nNOS陽性神經(jīng)元，胞體均以中、小型細胞為主，大型細胞相對較少，胞體輪廓和突起清晰。其中揚子鱷以橢圓形、梭形細胞為主，圓形細胞和多角形細胞均較少;大鼠以梭形、橢圓形細胞為主，圓形、多角形細胞次之。見圖2，表1～3。

圖2 揚子鱷、大鼠延髓nNOS陽性神經(jīng)元(免疫組化染色，×400)Fig 2 nNOS positive neurons in the medullar oblongata for the rats and A.sinensis(IHC，×400)

表1 兩種動物延髓nNOS陽性神經(jīng)數(shù)量及灰度值比較(±s)Tab 1 Comparison of the number and gray value of nNOS positive neurons in the medulla oblongata for the rats and A.sinensis(±s)

表1 兩種動物延髓nNOS陽性神經(jīng)數(shù)量及灰度值比較(±s)Tab 1 Comparison of the number and gray value of nNOS positive neurons in the medulla oblongata for the rats and A.sinensis(±s)

細胞總數(shù) 灰度值類別內(nèi)側(cè)部 外側(cè)部揚子鱷 21.33 ±3.98 22.75 ±2.46 160.15 ±11.87166.35 ±內(nèi)側(cè)部 外側(cè)部16.21大鼠 66.07 ±7.14 64.47 ±8.59 98.22 ±7.47 98.18 ±8.77 t/t' 14.341 17.120 14.499 12.581 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 兩種動物延髓不同形態(tài)nNOS陽性神經(jīng)元的百分比(%)Tab 3 The shape of nNOS positive neuron in the medulla oblongata for rats and A.sinensis(%)

3 討論

近年來的研究表明，NO是NOS催化L-精氨酸生成胍氨酸過程中同時產(chǎn)生的，無論在中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中都擔負著重要的信息傳遞任務(wù)，在感覺和運動的傳導、內(nèi)臟活動、睡眠與覺醒以及呼吸活動的調(diào)節(jié)中起重要作用;根據(jù)NOS的性質(zhì)結(jié)構(gòu)及其對鈣的依賴性不同，可分為兩大類，即Ca2+依賴性的結(jié)構(gòu)型NOS和非Ca2+依賴性的誘導型(iNOS)，前者又根據(jù)存在的部位和分子的大小不同又分為神經(jīng)元型(nNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最多的是 nNOS［7，9］。

延髓是腦干的重要組成之一，延髓內(nèi)有三叉神經(jīng)脊束核、孤束核、疑核、副神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核等感覺、運動性中繼核團，還有中央網(wǎng)狀核、外側(cè)網(wǎng)狀核等參與構(gòu)成上行網(wǎng)狀激動系統(tǒng)，并是呼吸、心血管等生命中樞所在部位。有研究表明大鼠延髓NOS陽性神經(jīng)元的分布，無論是在常氧還是在缺氧條件下，延髓產(chǎn)生的一氧化氮(NO)在節(jié)律性呼吸活動中的調(diào)節(jié)都具有重要作用［5－6］。我室以往對NO的研究大多采用NADPH-d組織化學方法顯示NOS在揚子鱷、大鼠腦組織中的分布［3－4，8］。本實驗采用免疫組織化學方法觀察到揚子鱷延髓的中央管周圍灰質(zhì)等處均可見到成團或散在的nNOS陽性神經(jīng)元分布，并對所觀察到的nNOS陽性神經(jīng)元的大小、形態(tài)特征進行了詳細描述，本實驗結(jié)果為進一步研究揚子鱷腦的形態(tài)與功能積累了一定的資料。但因至今沒有揚子鱷腦的核團圖譜參照，致使實驗中所觀察到的nNOS陽性神經(jīng)元具體位于哪些核團難以作出明確描述。

揚子鱷在進化過程中處于由水生到陸生的關(guān)鍵過渡階段，本實驗同時取大鼠延髓相同節(jié)段進行對比觀察，結(jié)果顯示大鼠延髓內(nèi)、外側(cè)部的諸多核團內(nèi)nNOS的表達比揚子鱷明顯增多。有研究認為，在哺乳類動物大鼠腦干nNOS陽性神經(jīng)元可通過其所分泌的NO對其他神經(jīng)遞質(zhì)起調(diào)節(jié)作用，并參與內(nèi)臟活動、感覺和運動的傳導，以及睡眠和覺醒等腦的高級整合功能的調(diào)節(jié)，在節(jié)律性呼吸活動中的調(diào)節(jié)都具有重要作用［6，10］。本實驗結(jié)果提示延髓內(nèi)nNOS的表達隨從爬行類到哺乳類動物的進化而相應(yīng)增加，延髓nNOS陽性神經(jīng)元在生物進化過程中對物種的感覺和運動的傳導，內(nèi)臟活動、以及睡眠和覺醒等腦的高級整合功能的調(diào)節(jié)中可能扮演了重要角色。揚子鱷與大鼠延髓內(nèi)、外側(cè)部nNOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量、細胞平均灰度值及細胞的大小形態(tài)等分布特征均存在一定差異，可能與不同物種動物執(zhí)行相關(guān)功能的復雜程度有關(guān)，但確切機制有待進一步研究。

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