洪婧妮，蘇永全，毛 勇，孫田田，王 軍

（廈門大學海洋與地球學院，福建 廈門361102）

真 蛸 （Octopus vulgaris）隸 屬 于 軟 體 動 物 門（Mollusca）、頭足綱（Cephalopoda）、八腕目（Octopoda）、無須亞目（Incirrata）、蛸科（Octopodidae）、蛸屬（Octopus），具有生活史短、生長速度快、食物轉化率高、對飼養(yǎng)環(huán)境和人工運輸具有較強的耐受力和適應力等諸多優(yōu)良的養(yǎng)殖生物學特性［1－2］.真蛸是暖溫種，在26℃以上水溫難于生存，有關其適宜生長溫度已有所研究［3－4］.

生物體在常態(tài)下保持體內活性氧的收支平衡，已有研究發(fā)現(xiàn)，高水溫會使變溫生物細胞吞噬活性增強，從而導致大量活性氧爆發(fā)［5－6］，過量的自由基如未能及時清除，會對機體的脂質代謝、酶活性和DNA等造成嚴重損害［7］.為了避免過剩的自由基對機體造成損傷，生物體內形成一套抗氧化系統(tǒng)，在清除過量自由基，保持機體活性氧動態(tài)平衡中起到了重要作用［8－10］.

1957年Mills等在牛紅細胞中發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽（GSH）過 氧 化 物 酶 （glutathione peroxidase，GPX）［11］，之后發(fā)現(xiàn)該基因為硒蛋 白，具 有催化 基團——硒代半胱氨酸（Selenocysteine，Sec U）［12－13］.至今已發(fā)現(xiàn)了7種GPX種類，其中細胞內GPX1（cGPX）是第一個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物硒蛋白，也是目前克隆得到較多的類型.1863年首次發(fā)現(xiàn)一類具有分解過氧化氫作用的酶，1901年該酶被正式命名為過氧化氫酶（catalase，CAT），之后通過實驗證實卟啉環(huán)是CAT的活性中心［14］.這2個基因主要在抗氧化系統(tǒng)中起到了清除過氧化氫的作用，保護生物體免受過氧化氫過量積累所帶來的損傷［15］.

本文克隆了真蛸GPX（OvGPX）和真蛸CAT（OvCAT）基因全長，研究了2個基因氨基酸結構特性，以及其在高溫條件下的表達特征，以期詮釋真蛸抗氧化酶蛋白的功能，揭示環(huán)境脅迫下OvGPX和OvCAT蛋白對于真蛸的保護作用，為真蛸的良種選育和資源保護等方面提供基礎資料和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物的暫養(yǎng)和取樣

本文所用的真蛸來自福建省霞浦縣北壁海區(qū)，帶回實驗室以活蟹和貝類喂食、蓄養(yǎng)1周（水溫22～24℃，鹽度26～27）后：1）選活潑正常的真蛸，取其消化腺置于由百泰克公司購買的RNA fixer保存液中，4℃過夜后移入－20℃冰柜保存、備用；2）選28只健康活潑的個體，經(jīng)相應水溫馴化恒定后，分別暫養(yǎng)在4個溫度組（24，26，28，30℃）中，每個溫度組7只個體，2h后各組隨機取3只個體，分別取其消化腺和櫛鰓，同上處理保存?zhèn)溆?

1.2 RNA提取、cDNA合成和基因全長的獲得

總RNA提取利用Trizol方法，Trizol試劑購自TaKaRa公司，具體實驗步驟按說明書進行.提取的RNA樣品存放于－80℃冰箱中保存，采用ND1000微量紫外－可見分光光度計檢測RNA的純度和濃度；RNA第1鏈反轉錄采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M－MLV 試 劑 盒 進 行，利 用 Oligo dT－RA為反轉錄引物，反轉錄實驗根據(jù)說明書操作，所得cDNA用作3′RACE模板.

反轉錄后的第1鏈cDNA，用NEB公司的RNahase試劑在37℃降解1h，加入2倍體積乙醇于－20℃ 靜置30min，4℃離心沉淀30min，加入超輕水（DDW）溶解，作為5′加尾的模板.5′加尾反應體系為：19μL cDNA溶液，依次加入5×TdT緩沖液10μL，TdT 酶 （15U／μL）1μL，dATP（0.5mmol／L）2.5 μL，0.1%（質量分數(shù)）牛血清白蛋白（BSA）5μL，加DDW補齊至50μL，試劑均購自TaKaRa公司，37℃溫育30min，所得即為5′端模板.

利用cDNA 末端快速克?。╮apid amplification of cDNA ends，RACE）［16］的方法對 OvGPX 和 OvCAT基因全長進行克隆，基因片段序列源自本實驗室構建的真蛸神經(jīng)系統(tǒng)轉錄組文庫［17］，片段用于進一步擴增.設計參與3′RACE的特異性引物分別為GPX－F1、GPX－F2、CAT－F1、CAT－F2；5′RACE 的反應特異性引物為 GPX－R1、GPX－R2、CAT－R1、CAT－R2（引物序列詳見表1）.

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，利用鷺隆公司的凝膠回收試劑盒進行膠回收；將純化后的PCR產(chǎn)物利用TaKaRa公司的pMD19－T載體進行克隆，用DH5α感受態(tài)細胞進行轉化，感受態(tài)細胞試劑盒購自鷺隆公司，具體操作步驟根據(jù)說明書進行.轉化后氨芐培養(yǎng)基培養(yǎng)16h，隨機挑選6個克隆，PCR反應和瓊脂糖凝膠檢測后送南京金斯瑞公司測序.

1.3 序列分析和多重序列比對

通過 Blast（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）查找同源序列，利用ClustalX和Dnaman軟件進行多序列同源比對；以ORFfinder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／orfig.cgi）進行開放閱讀框（ORF）查找；在線 Protparam （http：∥web.expasy.org／cgi－bin／protparam／protparam）軟件分析氨基酸序列組成、分子質量和等電點；Smart在線軟件、Interproscan在線軟件預測編碼蛋白的基因特征基序、功能域（http：∥www.ebi.ac.uk／Tools／pfa／iprscan／、http：∥smart.embl－h(huán)eidelberg.de／）；利用 SECISearch2.19在 線 軟 件 （http：∥genome.unl.edu／SECISearch.html）預測GPX是否存在硒半胱氨酸（Sec）插入序列（SECIS）結構；利用 NetNGlyc軟件（http：∥www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）預測GPX和CAT糖基結合位點.

1.4 實時定量PCR（qPCR）檢測不同溫度下OvGPX和OvCAT的基因表達變化

為了解OvGPX和OvCAT基因在不同溫度應激下的表達變化，本文以不同溫度組的消化腺和櫛鰓的cDNA第1鏈為模板進行qPCR反應.RNA提取和反轉錄反應分別采用百泰克公司的RNA Plus試劑盒和TaKaRa公司的 PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒，按說明書進行實驗操作.應用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒，在 Rotor－gene3000熒光實時定量熱循環(huán)儀上進行qPCR反應，實驗步驟參照說明書進行.合成基因特異性引物GPX－F、GPX－R、CAT－F和 CAT－R用于該實驗，以β－actin 基因作為qPCR的內參基因（序列見表1）.根據(jù)qPCR給出的Ct值，取3個平行樣本的平均值，利用2－ΔΔCt方法計算2個基因mRNA的相對表達量.

表1 實驗用引物表Tab.1 Primers used in this study

1.5 統(tǒng)計分析

利用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式，顯著性分析水平為p＜0.05，并做柱狀圖.

2 結 果

2.1 OvGPX和OvCAT基因序列分析

以RACE方法，拼接得到OvGPX基因.得到的OvGPX cDNA全長為925bp，包含5′非編碼區(qū)（5′UTR）36bp，3′非編碼區(qū)（3′UTR）316bp，ORF 573 bp，共編碼190個氨基酸，推測分子質量21.5ku，等電點pI為7.81.OvGPX推導的氨基酸序列（圖1）含有GPX家族2個典型酶活性位點基序，分別是從28GKVILVENVASLUGTT43和64LGFPCNQF71；并含有特有的Sec，利用SECISearch2.19在線軟件在OvGPX基因的3′UTR處預測到1個SECIS，全長91bp（圖2），含1個頂環(huán)和1個AG－GA SECIS核，頂環(huán)處存在保守的AAA序列.

得到的 OvCAT 全長為2 109bp，包含5′UTR 135bp、3′UTR 435bp和ORF 1 539bp，共編碼512個氨基酸，推測分子質量58.3ku，等電點pI為8.76（圖3）.通過功能域預測，推導的OvCAT氨基酸序列含有1個過CAT活性位點（61FNRERIPERVVHAKGAG77）、1個近端血紅素配體標簽序列（351RLYSYSDT358）和1個酶免疫響應區(qū)（位點428～494）.并發(fā)現(xiàn)了3個參與過氧化氫酶催化位點（His－71，Asn－144和 Tyr－354），同時預測到了3個糖基結合位點NASL、NYSQ、NVSS.

圖1 OvGPX的核苷酸和推導氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of OvGPX cDNA

圖2 OvGPX基因的SECIS元件示意圖.2The SECIS functional element of OvGPX

2.2 OvGPX和OvCAT基因氨基酸序列同源性分析

通過Blast、Clustal X和DNAman等分析軟件，將OvGPX推導的氨基酸序列與8種脊椎動物和無脊椎動物的GPX氨基酸序列進行多序列分析（圖4）.結果表明OvGPX氨基酸序列高度保守，所有比對序列基本都含有GPX的2個酶活性位點基序，且都有Sec.與曼氏無針烏賊（Sepiella maindroni）的 GPX氨基酸序列同源性最高（74%），與人類（Homo sapiens）的GPX氨基酸序列同源性也達60%.

將本實驗得到的OvCAT的氨基酸序列與8種已有動物的CAT氨基酸序列進行多重序列比對（圖5）.結果顯示，所比對物種的CAT氨基酸序列高度保守，基本都含有CAT的特征基序和3個參與催化的殘基.比對結果顯示，不同物種相似性較高，OvCAT氨基酸序列與同是軟體動物門的香港巨牡蠣（Crassostrea hongkongensis）和 盤 鮑 （Haliotis discus）的CAT氨基酸序列相似性高達76%和75%，與人類的CAT氨基酸序列相似性也有68%.

圖3 OvCAT的核苷酸和推導氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of OvCAT cDNA

圖4 OvGPX氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of OvGPX amino acid sequences

2.3 OvGPX和OvCAT基因mRNA在不同溫度下的表達分析

以qPCR方法分析了OvGPX基因在24，26，28和30℃不同溫度組處理2h后消化腺和櫛鰓的mRNA表達量差異（圖6）.

在消化腺和櫛鰓中，OvGPX mRNA表達量均在28℃組最高，分別達到24℃組的7.57倍（p＜0.01）和2.19倍.在30℃組，櫛鰓OvGPX mRNA的表達水平下降，只有24℃組的1／3（p＜0.05）；而消化腺中OvGPX mRNA的表達量與室溫組沒有顯著差異.

不同溫度組處理2h，真蛸消化腺和櫛鰓中OvCAT mRNA的表達量差異如圖7，在消化腺和櫛鰓中，28℃組OvCAT mRNA表達量明顯升高，分別達到24℃的2.36倍（p＜0.01）、2.13倍（p＜0.01）；在消化腺中26和30℃組的OvCAT mRNA表達量與24℃組無顯著差異；櫛鰓的OvCAT mRNA表達水平在30℃組低于24℃組，為24℃組的0.57.

不同溫度組qPCR結果表明，OvGPX和OvCAT 2個基因的表達水平在不同溫度組的表達差異相似，但是OvGPX的mRNA表達量變化波動較OvCAT明顯.

3 討 論

本文研究得到的OvGPX cDNA全長，除了具有2個高度保守的特征基序，預測的氨基酸序列中還發(fā)現(xiàn)了由UGA編碼的Sec U，這是GPX的中心催化基團，能夠催化GSH分解體內的氫過氧化物，從而防止細胞膜和其他生物組織遭受過氧化損傷［12－13］.UGA在一般情況下作為終止密碼子，但在OvGPX基因中，其主要編碼被稱為第21種氨基酸的Sec［18］.該編碼依賴硒元素，當細胞生長缺乏硒時，硒蛋白的翻譯會在UGA密碼子處中止，成為不完整而沒有功能的蛋白；而破譯UGA使其編碼Sec需要SECIS元件［19］的作用，SECIS元件是一個位于GPX基因3′UTR部分的一個莖－環(huán)發(fā)卡結構，本文得到的OvGPX基因，在3′UTR區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)了SECIS序列，這段序列由螺旋莖和頂環(huán)、內環(huán)組成，在莖的基部具有保守的AUGAC和UGAC形成的形成非 Watson－Crick雙鏈，結構完整，這個完整的SECIS元件保證了OvGPX基因的正確轉錄.SECIS元件的分類主要根據(jù)保守的AAA序列是否位于頂環(huán)進行判斷，本研究得到的OvGPX基因的SECIS元件，AAA序列位于頂環(huán)，與人類的OvGPX1一樣屬于一類［20－21］.

圖5 OvCAT氨基酸序列比對Fig.5 Alignment of OvCAT amino acid sequences

圖6 qPCR方法下的OvGPX在不同溫度的表達量Fig.6 The expression of OvGPX at different temperatures by qPCR

圖7 qPCR方法下的OvCAT在不同溫度的表達量Fig.7 The expression of OvCAT at different temperatures by qPCR

水生動物受到熱應激后的抗氧化酶的活性變化有所差異，翡翠貽貝（Perna viridis）熱激后，SOD、CAT、GST、GPX等酶活力都明顯的高于對照組［22］；雙線血蛤（（Hiatula diphos）和中國血蛤（Hiatula chinensis）在20～70℃不同的水溫刺激下，CAT酶活性變化趨勢表現(xiàn)為先上升，后下降，且雙線血蛤的變化幅度比中國文蛤明顯［23］；在對盤鮑的28℃熱應激研究中發(fā)現(xiàn)，GPX、CAT和SOD 3個基因的mRNA表達量在熱應激后均上調［24］.可見，熱激強度不同和熱激時間的長短，對抗氧化酶活性造成的變化并不相同，而同一實驗條件下，不同物種的GPX或CAT酶活性變化也有差異.這些結果說明GPX和CAT這2種抗氧化酶參與熱應激后的自由基清除活動，保證了機體免受過度自由基損傷.本實驗中，不同的溫度應激后，消化腺中的OvGPX和OvCAT基因的mRNA表達量在應激條件下均有上升，體現(xiàn)了2個抗氧化基因在熱應激壓力下清除過氧化氫，保護機體的積極作用；櫛鰓OvGPX和OvCAT的mRNA表達量在28℃組有所升高，26和30℃組表達量下降，說明消化腺和櫛鰓抗氧化能力可能有所不同.本文不同強度的熱應激實驗結果顯示，OvGPX mRNA表達量的變化幅度明顯大于OvCAT，顯示了OvGPX對氧化應激較為敏感.

本文克隆了OvGPX和OvCAT基因全長，并探索2個基因在不同熱激強度下的表達情況，初步確定2個基因參與熱應激脅迫后的抗氧化反應.這些數(shù)據(jù)為進一步研究OvGPX和OvCAT的生物學功能提供有效信息，并為深入探索頭足類動物的抗氧化體系奠定理論基礎.

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