楊少梅，侯 瑾，黃志寧，李福男

（廈門大學藥學院，福建 廈門361102）

紫杉醇（Paclitaxel）又名泰素，最早由 Monroe E Wall和 Mansukh C Wani從太平洋紅豆杉（Taxusbrevifolia）的樹皮中分離得到，并命名為紫杉醇［1］.紫杉醇具有獨特的作用機制，研究報道指出其能誘導與促進微管蛋白聚合、微管裝配與微管穩(wěn)定，抑制細胞有絲分裂，從而阻止腫瘤細胞的生長［2］.臨床數(shù)據(jù)表明，紫杉醇對乳腺癌、卵巢癌、肺癌等有良好的療效.對其藥物機理的研究一直是該藥的研究熱點之一［3］.

人血清白蛋白（HSA）是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，具有儲運內源性代謝產(chǎn)物和外源性藥物小分子（離子）等重要生理功能，參與許多重要的生命過程［4］.藥物進入血液后，先和 HSA結合成復合物（可逆），然后再被運輸?shù)綑C體的各個部位進行釋放.因此研究HSA與藥物的結合具有多重的理論和現(xiàn)實意義.

本研究采用等溫滴定量熱法對紫杉醇分子與HSA間的相互作用進行了研究，對傳統(tǒng)的光譜學研究是一種補充，同時也取得了一些有意義的結果.測定物質相互作用焓變和熵變，可從原子和基團的性質、取向、位置和距離的變化等更加微觀的層面上理解對其與HSA相互作用的規(guī)律，能夠系統(tǒng)地研究紫杉醇分子在血液中的運輸與傳遞等與HSA的相互作用.配體的熱力學特征與配體－蛋白復合物的結構生物學特征相結合，深入揭示配體－受體的結合本質，對開發(fā)安全高效的抗腫瘤藥物作用提供分子機制的理論支持.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary eclipse型熒光分光光度計（Varian，USA），Cary 50－bio型 紫 外－可 見 分 光 光 度 計 （Varian，Australia），ITC 200型等溫滴定量熱儀（GE，USA），ICM 3.3－04a（Molsoft，USA），Millipore超純水系統(tǒng)（Millipore）.紫杉醇（Sigma，USA），HSA （Sigma，USA）.

1.2 方 法

1.2.1 熒光光譜實驗

實驗從3個溫度（293，303和310K）考察紫杉醇對HSA的熒光猝滅.HSA濃度為5μmol／L（溶于1 mol／L的pH為7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）中）.紫杉醇溶于二甲基亞砜（DMSO）中，使用時用PBS稀釋至終濃度5mmol／L，以含等量的DMSO的PBS作為陰性對照.實驗激發(fā)波長為285nm，狹縫寬度為5nm.

1.2.2 紫外－可見吸收光譜實驗

實驗于303K下進行，HSA濃度為1μmol／L（溶于1mol／L的pH 為7.4的PBS中）.紫杉醇溶于DMSO中，使用時用PBS稀釋至終濃度1mmol／L，以含等量的DMSO的PBS作為陰性對照.掃描范圍250～300nm.

1.2.3 等溫滴定量熱實驗

等溫滴定量熱實驗在ITC200型等溫滴定量熱儀上進行.設定起始補償功率（DP）值為5.將50μmol／L HSA（溶于含質量分數(shù)5%DMSO的PBS中）溶液注入200μL的量熱池，紫杉醇溶于1mol／L的PBS（5%DMSO，pH 7.4）中，滴定濃度為5mmol／L.反應維持溫度在303K，控制攪拌速率為1 000r／min，間隔時間120s，每次的滴定體積為2μL，分20次完成，基線穩(wěn)定后啟動實驗.以等濃度的紫杉醇滴定200μL的1 mol／L的PBS（5%DMSO，pH 7.4）作為扣除紫杉醇的稀釋熱的空白對照.

1.2.4 分子對接實驗

紫杉醇與 HSA的結合作用在 Molsoft ICM3.3－04a軟件進行模擬.選擇蛋白質數(shù)據(jù)庫中HSA的晶體結構（ID 4IW1）作為對接模型，運用ICM3.3－04a進行蛋白質結構轉換和構象調整，并由Icmpocketfinder自動產(chǎn)生結合位點.通過Refine程序對蛋白質與紫杉醇對接結構進行柔性處理后進行對接實驗.

2 結果與討論

2.1 紫杉醇與HSA相互作用的熒光光譜

2.1.1 熒光猝滅機制

由于HSA分子中存在色氨酸和酪氨酸2個生色基團，因此使其具有內源熒光的特性［5］.本文以285 nm的激發(fā)光為激發(fā)波長，在290～500nm波長范圍內測定HSA溶液的熒光發(fā)射光譜.結果表明，在高能量激發(fā)光作用下，HSA在340nm波長處出現(xiàn)了熒光（圖1（a））.從圖1（a）可以看出，HSA 濃度保持不變，其內源性熒光隨著紫杉醇濃度的增加逐步猝滅，說明紫杉醇改變了HSA的微環(huán)境，提示二者可能發(fā)生相互作用［6］.

熒光猝滅過程通常分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩類.動態(tài)猝滅是由猝滅劑和熒光物質之間發(fā)生相互碰撞而引起，而靜態(tài)猝滅則是猝滅劑和熒光物質形成了穩(wěn)定的復合物而引起的猝滅［7］.對于純動態(tài)或者純靜態(tài)猝滅，其作用過程均遵循方程（1）［8］：

式中，F(xiàn)0是HSA溶液的熒光強度，F(xiàn)是加入紫杉醇后HSA溶液的熒光強度，cQ是體系中紫杉醇的總濃度，KSV是Stern－Volmer猝滅常數(shù)，且由下式定義：

式中，Kq是由擴散過程控制的碰撞動態(tài)猝滅速率常數(shù)［L／（mol·s）］，τ0生物大分子內源性熒光壽命值為10－8s［9］.本文在不同溫度下（293，303，310K），根據(jù)式（1）以F0／F對cQ的關系作圖（圖1（b））.結果顯示，Stern－Volmer曲線呈現(xiàn)良好的線性關系，且隨著溫度升高曲線斜率逐漸降低，表明動態(tài)碰撞不是引起HSA熒光猝滅的主要原因，而是由于藥物和蛋白形成了復合物，從而引起的靜態(tài)猝滅［10］.經(jīng)式（1）擬合計算得出，猝滅常數(shù) Ksv分別為15.1×103，13.6×103和11.8×103L／mol.由式（2）進一步得到碰撞動態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq分別為15.1×1011，13.6×1011和11.8×1011L／（mol·s），由于各類猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞動態(tài)猝滅常數(shù)為2.0×1010L／（mol·s），進一步說明紫杉醇對HSA的熒光猝滅是由于形成復合物引起的靜態(tài)猝滅［11］.

圖1 紫杉醇與HAS熒光測定結果Fig.1 The fluorescence result of HSA and Paclitaxel

2.1.2 紫杉醇與HSA的結合常數(shù)KA、結合位點數(shù)n

設紫杉醇與HSA形成n個結合位點的復合物，由Lineweaver－Burk公式（3）可獲得 KA和n［12－13］：

圖2 紫杉醇與HSA結合的Lineweaver－Burk線性圖Fig.2 Lineweaver－Burk plot for the binding of Paclitaxel with HSA

2.2 紫杉醇與HSA相互作用的熱力學分析

2.2.1 紫杉醇與HSA作用力類型的判斷

猝滅體和生物大分子的相互作用力主要有氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水力［14］.當溫度相差不大時，可以把反應焓變看成一個常數(shù)，兩物質間相互作用的熱力學參數(shù)符合下列關系［15］：

其KA為不同溫度下對應的結合常數(shù)，與為焓變與熵變，為吉布斯自由能，是判斷一個反應是否能自發(fā)進行的標準.R是熱力學氣體常數(shù)，取值為8.314（mol·K）／J，T 是熱力學溫度.通過式（4）和（5）可以求出熱力學常數(shù)的變化，結果見表1.

2.2.2 等溫滴定量熱法檢測HSA與紫杉醇的相互作用

大分子與小分子間的相互作用常伴隨著一個能量的改變.由于小分子的加入，大分子在溶液中微環(huán)境的改變，原有的各種化學鍵被破壞，小分子與大分子間重新形成新的化學鍵，因此會產(chǎn)生一個吸熱或者放熱的效應.本文以測定注入紫杉醇后含HSA的樣品池所釋放或吸收的熱量為基礎，獲得兩物質相互作用的熱力學參數(shù).如圖3所示，紫杉醇與HSA反應屬于放熱反應，隨著紫杉醇濃度的逐漸增大，二者之間的結合呈現(xiàn)一個飽和的趨勢.

對于藥物配體（紫杉醇）與蛋白質（HSA）的結合過程，其基本假設為一個蛋白質分子可有：1）i類結合位點，它們可結合相同的配體，同類中的所有位點在熱力學意義上是相同的；2）i類結合位點相互獨立，即蛋白質分子的每一類受體位點與藥物配體的結合率彼此互不依賴.基于上述假設和Langmuir結合理論有［17－18］：

式中cL，0和cP，0分別為藥物配體紫杉醇和HSA的初始濃度，cL是結合過程達到平衡狀態(tài)時藥物配體的游離濃度，θi、Ki和Ni分別是第i類結合位點的結合率、結合常數(shù)和結合位點數(shù).將式（6）代入式（7）可得公式（8）：

表1 HSA與紫杉醇相互作用的熱力學參數(shù)Tab.1 The thermodynamic parameters for the interaction between Paclitaxel and HSA

圖3 紫杉醇與HSA等溫滴定結果Fig.3 The isothermal titration result of HSA and Paclitaxel

等溫滴定量熱實驗中第j次注射所得到的熱量（Qj）可表示為：

式中，Vcell是反應池中被滴定劑的體積，Δθi是從第（j－1）次滴定到第j次滴定第i類結合位點結合率的變化是第i類位點的結合焓，也就是每摩爾的藥物分子與結合位點結合過程標準焓的變化.cL，0和cP，0是已知量并且Qj可以通過量熱實驗得到.事實上，Qj是關于Ni，Ki和的函數(shù).基于上述理論，假設HSA與紫杉醇的結合位點為1，利用ITC200自帶的origin7.0軟件的one bindsite模式以紫杉醇與HSA物質的量濃度比為橫坐標，對應反應放熱量為縱坐標作圖，進行非線性最小方差擬合，如圖3（b）所示，可以得到紫杉醇與HSA之間相互作用的熱力學參數(shù).經(jīng)擬合，確定二者間結合常數(shù)Ki為8.8×103L／mol，焓變?yōu)?－99.1kJ／mol，熵 變?yōu)?－183.6 J／（mol·K），吉布斯自由能為－43.5kJ／mol，與熒光光譜分析結果基本一致.

2.3 紫杉醇與HSA相互作用的紫外－可見吸收光譜

動態(tài)猝滅僅影響熒光體的激發(fā)態(tài)，卻不影響熒光體的吸收光譜，而基態(tài)配合物的形成則會引起熒光體的吸收光譜的變化.本實驗分別測定了HSA、HSA與紫杉醇混合溶液（以相應的紫杉醇為空白）的紫外吸收光譜 （圖4－a，b，c，d，e，f）.實驗結果表明：HSA 在278nm處有一吸收峰，一般認為278nm處的吸收主要來源于芳香族氨基酸色氨酸，酪氨酸以及苯丙氨酸.加入紫杉醇后，HSA在250～300nm波長范圍內吸光度增大，說明HSA與紫杉醇確實有結合.

圖4 溫度為303K時紫杉醇對HSA紫外吸收光譜的影響Fig.4 The ultraviolet absorption spectra of HSA which caused by Paclitaxel at 303K

由圖4可以看出，紫杉醇的加入使HSA在278 nm波長處的吸收峰強度升高，峰的位置稍微藍移，這說明紫杉醇與HSA基態(tài)分子發(fā)生了相互作用，形成了基態(tài)配合物，從而引起了HSA紫外吸收光譜的變化.動態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，并不改變熒光物質的吸收光譜，因此可以進一步說明紫杉醇對HSA的熒光猝滅機制為靜態(tài)猝滅.

2.4 紫杉醇與HSA之間的距離

根據(jù)Fǒrster提出的偶極－偶極非輻射能量轉移理論，當2種化合物分子滿足以下條件將會發(fā)生非輻射能量轉移現(xiàn)象［19－20］：1）供體能發(fā)熒光；2）供體的熒光發(fā)射光譜與受體的紫外－可見吸收光譜有足夠重疊；3）供體與受體足夠接近，最大距離不超過7 nm.HSA有很強的熒光，觀察紫杉醇的紫外－可見吸收光譜，發(fā)現(xiàn)其與HSA的熒光光譜有著較大程度的重疊.HSA的熒光光譜和紫杉醇的紫外－可見吸收光譜見圖5.

圖5 HSA熒光發(fā)射光譜（a）與紫杉醇紫外－可見吸收光譜（b）的重疊圖Fig.5 The overlap spectra of the fluorescence emission spectrum of HSA （a）and the absorbance spectrum of Paclitaxel（b）

供體分子與受體分子發(fā)生能量轉移時，非輻射能量轉移效率E、供體與受體間距離r及臨界能量轉移距離R0有如下關系［21］：

式中，F(xiàn)0為熒光發(fā)射體的初始熒光強度；F為當微環(huán)境中受體分子濃度與熒光發(fā)射體濃度相等時熒光發(fā)射體的熒光強度；k2為偶極空間取向因子，平均值為2／3；N為介質折射常數(shù)，值為1.366；Φ 為 HSA的熒光量子產(chǎn)率，通常取蛋白質中色氨酸的量子產(chǎn)率0.15；J為供體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊區(qū)域，其積分公式為：

式中，F(xiàn)（λ）和ε（λ）分別代表在波長λ處 HSA的熒光強度和紫杉醇的摩爾吸光系數(shù).當二者濃度均為5 μmol／L時（圖5），重疊面積J可由式（13）計算得到，值為1.413（cm3·L）／mol.經(jīng)計算得出在溫度為303 K時，供體分子（HSA）與受體分子（紫杉醇）的熒光共振能量轉移的效率E為4.5%，二者間的作用距離r為3.1nm.

2.5 紫杉醇與HSA的分子對接

運用ICM3.3－04a軟件進行HSA蛋白的結構轉換和加氫處理，由Icmpocketfinder自動產(chǎn)生一個半徑約為8nm的結合口袋，其兩側主要由α－螺旋和無規(guī)卷曲結構圍成，該口袋即為紫杉醇與其的結合位點（圖6（a））.

如圖6（b）所示，疏水性氨基酸殘基（如L115，V186，F(xiàn)509以及L529等）組成疏水核心，而E17，K195，R212，D340，R222及K436等則位于親水表面.分子對接結果表明，紫杉醇通過與K58，K195，R222及K436殘基之間的氫鍵等作用力結合在HSA的結合口袋中，氫鍵和范德華力是二者間結合的主要結合作用力，該結果與熒光光譜和等溫滴定量熱法所推斷的結果相一致.

3 結 論

圖6 HSA與紫杉醇的對接結果Fig.6 Docking result of Paclitaxel with HSA

本實驗采用光譜法及等溫滴定量熱法研究了模擬生理條件下紫杉醇與HSA的相互作用.結果表明，靜態(tài)猝滅是導致紫杉醇對HSA熒光猝滅的主要原因.根據(jù)Fǒrster提出的偶極－偶極非輻射能量轉移理論得出紫杉醇與HSA二者間的相互作用距離是3.1 nm，該作用距離表明了HSA與紫杉醇之間可發(fā)生非輻射能量轉移，其熒光共振能量轉移效率為4.5%.由不同溫度的熒光實驗得到二者間反應的熱力學參數(shù)可知，紫杉醇與HSA間的反應是熵驅動下自發(fā)進行（＜0）的反應，二者間的作用力以氫鍵和范德華力為主＜0，＜0）.等溫滴定量熱實驗進一步驗證了熒光光譜實驗的結果，證明了紫杉醇與HSA相互作用屬于自發(fā)進行的放熱反應.紫杉醇與HSA二者在303K時的結合常數(shù)僅為10.7×103L／mol（熒光結果）和8.8×103L／mol（等溫滴定量熱結果），遠遠小于配體與受體之間特異性結合的結合常數(shù)（107～1014L／mol），說明二者的結合屬于非特異性結合.二者間較弱的相互作用有利于紫杉醇在血液中的運輸及達到靶蛋白后的交換結合.

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